环磷酰胺致大鼠低转换型骨质疏松及复方丹参制剂的预防作用

摘要

用环磷酰胺造成大鼠低转换骨质疏松模型，观察复方丹参制剂的预防作用，并与阳性对照药物碳酸钙维D进行比较；为低转换型骨质疏松模型的建立及复方丹参制剂的二次开发提供实验依据。 【方法】 实验药物的制备及质量控制：取6批丹参和三七的中药材，据2005版药典所记载的复方丹参滴丸提取方法制备复方丹参制剂，随机编为1<'＃>、2<'＃>、3<'＃>、4<'＃>、5<'＃>、6<'＃>，并通过高效液相色谱法(色谱柱：Agilient C<,18>(250mm×4.65um，5um)；流动相：乙腈(A)-0.6％磷酸(B)，程序梯度洗脱：2％A(0min)-5％A(10min)-20％A(30min)-80％A(80min)；流速：1.0ml/min；温度为25℃；检测波长：280nm；进样量：10ul。)，制备其指纹图谱并考查其精密度、稳定性和重复性，并拟合丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B的标准曲线、计算1<'＃>复方丹参制剂和复方丹参滴丸(天力士制药股份有限公司，批号：Z10950111)中三者的含量及比例。 动物实验：50只3月龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，随机分成5组。1组为蒸馏水处理组(NS组)，其余4组先予大鼠灌喂4.5mg/kg/d的环磷酰胺造成骨质疏松的动物模型，然后分成环磷酰胺模型组(CP)、碳酸钙维D组(CS)、复方丹参制剂低剂量组(FDL)和高量组(FDH)，分别灌喂蒸馏水(CP)、碳酸钙维D(CS)0.4mg/kg/d、复方丹参制剂低剂量(FDL)2.13g/kg/d、高剂量(FDH)6.39g/kg/d，每天一次，连续15d。实验结束前13、14天和3、4天分别注射四环素和钙黄绿素作骨荧光标记。实验结束时，心脏取血处死大鼠，取左侧胫骨不脱钙包埋后分别制成骨切片和骨磨片，通过半自动图像分析系统进行松质骨(上段)和皮质骨(中段)的骨组织形态计量学测量；用858 Mini Bionix型材料测试系统分析大鼠第五腰椎(压缩实验)和右侧股骨(三点弯曲实验)的生物力学性能；最后，将生物力学检测后的骨材料烘干、消化，分成两份，分别使用ICP离子性发射光谱仪和羟脯氨酸试剂盒(经典法)检测其骨钙、磷、镁以及骨胶原的含量。 【结果】 1．复方丹参制剂的指纹图谱及主要成分含量测定 本研究制备的复方丹参制剂的指纹图谱见图3.5(page39)，通过对该指纹图谱的精密度、稳定性及重复性的考察，获得各色谱峰的相对保留时间及峰面积比值RSD％分别为0．2％～2％的结果，该结果符合指纹图谱所需要求，表明该复方制剂工艺稳定、质量可控。 丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B三种的标准品标准曲线见图3.1～3.4(page32～33)，图谱见图3.7(page40)。 根据丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B三种的标准品标准曲线及图谱，计算出本实验的复方丹参制剂中丹参素的含量为1.74mg/g；原儿茶醛的含量为0.11mg/g；丹酚酸B的含量为17.89mg/g；三者比例为1:0.06:10。对照药品复方丹参滴丸中丹参素的含量2.00mg/g；原儿茶醛的含量为0.54mg/g；丹酚酸B的含量为0.56mg/g;三者比例为1:0.27:0.28。其指纹图谱见图3.6(page40)。 经检测得知：低剂量的复方丹参制剂含丹参素O．74m咖1；原儿茶醛0.047mg/ml；丹酚酸B 7.62mg/ml。高剂量的复方丹参制剂含丹参素2.22mg/ml；原儿茶醛0.14mg/ml；丹酚酸B 22.9mg/ml。 2．环磷酰胺可使大鼠骨形成明显抑制：与NS组比较，大鼠予环磷酰胺灌喂15d后，骨形成作用受到抑制，骨量显著丢失，骨生物力学性能明显下降。表现在： ①松质骨的骨量明显减少，显微结构疏松退化。骨形态计量学研究观察到胫骨上段的静态参数中骨小梁面积百分率(％Tb．Ar)、骨小梁厚度(Tb．Th)和骨小梁数量(Tb．N)分别降低了48.7％、18％与37.8％；骨小梁分离度(Tb．Sp)增加了67.8％。 ②松质骨反映骨形成及骨矿化的指标明显下降。骨形态计量学研究观察到荧光周长百分数(％L．Pm)、骨矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR/BS、BFR/BV、BFRJTV)分别降低了50.8％、21.6％、61.1％、50％和72.2％。 ③皮质骨的骨量明显减少，骨髓腔增大，骨的形成和矿化被抑制。骨形态计量学研究观察到胫骨中段骨的皮质面积(Ct.Ar)下降15％，皮质面积百分数(％Ct.Ar)下降3.59％，骨髓面积百分数(％Ma．Ar)增加15.0％，骨外膜矿化沉积率(P-MAR)下降30.7％，骨形成率(P-FBR/BS)下降28.1％，以上差异均有统计学意义。 ④股骨和腰椎变得脆而易碎，骨折风险显著增加。骨生物力学检测观察到股骨、腰椎的最大载荷分别下降了14.8％和21.6％，弹性模量分别下降了27.7％和29.8％。 ⑤股骨单位骨量中的骨羟脯胺酸(Hyp)显著降低(P<0.05)，股骨和腰椎单位骨量中的骨钙、磷、镁的含量均显著降低(P<0.05)。 3．碳酸钙维D可明显促进环磷酰胺大鼠的骨形成和骨矿化作用：与CP组比较，碳酸钙维D能显著对抗环磷酰胺造成的骨丢失和骨形成抑制，有效提高骨质量，降低骨折风险，表现在： ①松质骨的骨量明显增加，结构紧密。骨形态计量学观察到胫骨上段的静态参数中％Tb．Ar、Tb．Th和Tb．N分别升高了82％、23.4％与45.5％。Tb．Sp减少了33.3％。 ②松质骨反映骨形成和骨矿化的指标明显上升。骨形态计量学研究观察到％L．Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分别升高了196.6％、68.8％、430.2％和320.9％。 ③皮质骨的骨量明显增加，骨髓腔缩小，骨的形成、矿化作用增强。骨形态计量学研究观察到％Ct．Ar、P-MAR、P-FBR/BS分别增长4.63％、36.3％、53.3％，％Ma．Ar则下降16.2％，差异均有统计学意义。 ④股骨和腰椎硬度明显增加，骨折风险显著下降。骨生物力学检测观察到股骨、腰椎的最大载荷分别增加了28.5％和15.5％，弹性模量分别增加了69.7％和38.3％。 ⑤股骨单位骨重量中的骨Hyp显著增加(P<0.05)，股骨和腰椎单位骨量中的骨钙、磷、镁的含量均显著升高(P<0.05)。 4．高、低剂量的复方丹参制剂均可明显促进环磷酰胺大鼠的骨形成和骨矿化作用：与CP组比较，高、低剂量均可有效对抗环磷酰胺所造成的大鼠骨丢失和骨形成抑制作用，能有效地增加股骨的生物力学性能，降低骨折风险。表现在： ①松质骨的骨量明显增加，结构致密有序。骨形态计量学观察到低、高剂量的复方丹参制剂分别使胫骨上段静态参数中的％Tb．Ar增加108.2％和124.6％，Tb.Th增加25.1％和39.1％，Tb.N增加62.8％和61.4％。Tb.Sp减少了36.3％和40.1％。 ②松质骨反映骨形成和骨矿化的指标明显上升。骨形态计量学观察到低剂量的复方丹参制剂使％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分别升高了83.5％、61.4％、201.8％和127.2％。高剂量的复方丹参制剂则使％L-Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV分别升高了203.8％、74％、458.7％、279.3％和610.3％。 ③高、低剂量的复方丹参制剂均可明显增加皮质骨的形成矿化活性，但骨量的增加，高剂量优于低剂量。骨形态计量学观察到高剂量组的％Ct.Ar、P.MAR、P-FBR/BS分别增长5.65％、27.8％、57.2％，％Ma.Ar降低19.8％，差异均有统计学意义；低剂量组中P-MAR、P-FBR/BS的增长率具有统计学意义，而％Ct.Ar和％Ma.Ar仅有一定的改善趋势，差异却不具统计学意义。 ④股骨和腰椎硬度明显增加，骨折风险显著下降。骨生物力学观察到高、低剂量的复方丹参制剂分别使股骨的最大载荷分别增加了19.5％和29.5％，弹性模量分别增加了71.8％和57.8％；腰椎的最大载荷分别增加了18％和24％，弹性模量分别增加了38.1％和28.8％。 ⑤股骨单位骨量中的骨Hyp显著增加(P<0.05)，股骨和腰椎单位骨量中的骨钙、磷、镁的含量均显著升高(P<0.05)。 【结论】 每天按4.5mg/kg大鼠体重的剂量连续给予环磷酰胺15天，可明显抑制大鼠的骨形成，导致骨丢失，并且降低骨的力学质量，骨形态计量学观察呈现低转换型骨质疏松的典型表现；碳酸钙维D可有效预防环磷酰胺导致的大鼠骨改变；按药典的方法制备的复方丹参制剂，对环磷酰胺导致大鼠的骨改变也有明显的抑制作用。此外，在促进骨形成，提高骨质量上比碳酸钙维D表现出更加优秀的作用，具有成为理想的抗骨质疏松药物的潜质。本研究通过指纹图谱的分析，观察到复方丹参制剂具有工艺稳定、质量可控等特点，且其中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B三者的含量比例为1:0.06:10，与复方丹参滴丸不同。

目录

声明

1.前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2.材料与方法

2.1实验动物与饲养条件

2.2实验设计与分组

2.3药物的制备和控制

2.4主要试剂和设备

2.5.实验方法

2.5.1高效液相法建立指纹图谱

2.5.2骨生物力学检测

2.5.3骨钙、磷及羟脯氨酸含量的测定方法

2.5.4骨组织形态计量学方法

2.5.5统计学分析

3.结果

3.1复方丹参制剂指纹图谱的研究

3.2复方丹参制剂对环磷酰胺大鼠体重的影响

3.3复方丹参制剂对环磷酰胺大鼠股骨的影响

3.4复方丹参制剂对环磷酰胺大鼠腰椎的影响

3.5复方丹参对环磷酰胺大鼠骨组织形态计量学的影响

4.讨论

4.1环磷酰胺对大鼠骨的药理学作用

4.2碳酸钙维D对环磷酰胺致大鼠骨质疏松的防治作用

4.3复方丹参制剂对环磷酰胺致大鼠骨质疏松的防治作用

5结论

参考文献

文献综述 复方丹参制剂的药理研究和临床应用进展

致谢

附录