奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究

摘要

卵母细胞和胚胎冷冻技术在家畜遗传资源保存方面具有广泛和潜在的应用价值。本试验用OPS管或GMP管对牛卵母细胞玻璃化冷冻和用麦管对胚胎程序化冷冻进行研究。在冷冻时，对基础液、不同发育阶段的牛卵母细胞、保护剂、冷冻载体、解冻步骤进行比较试验。同时研究三步平衡法和一步细管法冷冻牛胚胎和移植受胎率效果。 1.基础液中添加牛血清白蛋白或胎牛血清对GV期牛卵母细胞的冷冻效果。冻后对照组和两个试验组形态正常率分别为45％，65.1％，65.6％，成熟率分别为28％，44.4％，44.20％，卵裂率分别为11.7％,23.8％，21.3％，试验组与对照组差异显著，但添加BAS和FCS两组之间差异不显著。 2.不同发育阶段的牛卵母细胞玻璃化冷冻效果。冷冻GV期和MⅡ麓，结果形态正常率分别为71.3％和68.8％，差异不显著(p＞0.05)；成熟率分别为45％和47.6％，差异显著(p＜0.05)；卵裂率分别为23.3％和31.1％，差异显著(p＜0.05)。 3.不同颗粒细胞层数的牛卵母细胞玻璃化冷冻效果。裸卵，含2～4层颗粒细胞，颗粒细胞完整的卵母细胞冻后形态正常率分别为21.7％，60.3％，60.7％，成熟率分别为6.7％，46％，44.2％，卵裂率分别为1.6％，30.2％，24.6％。结果含2～4层颗粒细胞的卵母细胞冷冻效果最好。 4.不同玻璃化冷冻溶液对OPS法冷冻GV期牛卵母细胞体外发育的影响。在EFS30和EFS40液中，冻后形态正常率分别为67.2％和66.7％，差异不显著(p＞0.05)；成熟率分剐为36.2％和37.6％，差异不显著(p＞0.05)。在EDFS30和EDFS40中，冻后形态正常率分别为73.1％和75.4％，差异不显著(p＞0.05)；成熟率分别为42.9％和43.7％，差异不显著(p＞0.05)。而在EFS30液和EDFS30液中，冻后形态正常率分别为67.2％和73.1％，差异显著(p＜0.05)；成熟率分别为36.2％和42.9％，差异显著(p＜0.05)，EFS40与EDFS40在影响成熟率上差异也显著。 5.不同玻璃化冷冻溶液对GMP法冷冻GV期牛卵母细胞体外发育的影响，在EFS30和EFS40液中，冻后形态正常率分别为63.5％和63.9％，差异不显著(p＞0.05)；成熟率分别为33.7％和36.1％，差异不显著(p＞0.05)；在EDFS30液和EDFS40液中，冻后形态正常率分别为78.6％和75％，差异不显著(p＞0.05)；成熟率分别为43.8％和47.6％，差异不显著(p＞0.05)。EDFS30和EDFS40均是牛GV期卵母细胞良好的玻璃化冷冷冻液。 6.采用OPS法和GMP法冷冻牛GV期卵母细胞，在EFS40中冻后形态正常率分别为68.4％和74.1％，差异不显著(p>0.05)；成熟率分别为47.3％和48.4％，差异不显著(p>0.05)；在EDFS40液中冷冻后形态正常率分别为74.6％和75.4％，差异不显著(p>0.05)；成熟率分别为42.4％和49.1％，差异不显著(p>0.05)；OPS管和GMP管都是比较理想的冷冻载体。 7.不同解冻程序对玻璃化冷冻的牛卵母细胞发育影响。采用EFS30玻璃化冷冻液，OPS法冷冻GV期牛卵细胞，通过一步法，三步法，五步法解冻，形态正常率分别为32.3％,51.7％，49.1％，成熟率分别为25.4％,43.4％,36.7％，卵裂率分别为18.7％，30％，29.8％，三步解冻法效果较好。 8.程序化冷冻牛胚胎移植效果。采用三步平衡法和一步细管法，结果显示，用10％甘油作抗冻剂，三步平衡冷冻，三步解冻的胚胎移植后受胎率为38.3％和用15％乙二醇作抗冻剂一步细管法冷冻胚胎移植后受胎率为36.9％，两者差异不显著(p>0.05)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词(Abbreviations)

声明

第一章文献综述

1卵母细胞冷冻保存的意义及发展状况

1.1卵母细胞冷冻保存的意义

1.2卵母细胞冷冻保存的发展概况

2卵母细胞发育与低温冷冻的基本原理

2.1卵母细胞的发育

2.2卵母细胞低温冷冻原理

3卵母细胞在低温冷冻保存过程中受到的损伤

3.1细胞内冰晶损伤

3.2细胞外冰晶损伤

3.3破裂损伤

3.4渗透压损伤

3.5冷冻保护剂化学毒性损伤

3.6低温损伤

3.7 过冷损伤

4冷冻方法

4.1慢速冷冻法

4.2快速冷冻法

4.3玻璃化法

5冷冻保护剂

5.1冷冻保护剂作用原理

5.2渗透性冷冻保护剂

5.3非渗透性冷冻保护剂

5.4抗冻蛋白

5.5冷冻保护剂的筛选及处理方式

5.6冷冻保护剂的选择原则

6解冻及脱除冷冻保护剂的方法

6.1解冻

6.2降温与升温速率

6.3除去冷冻保护剂的方法

7影响卵母细胞冷冻的因素

7.1卵母细胞的不同发育时期对冷冻效果的影响

7.2卵母细胞脂肪含量对冷冻效果的影响

7.3卵母细胞外围结构对冷冻效果的影响

7.4混合保护剂

7.5冷冻方法的影响

7.6生物活性物质

8胚胎冷冻保存方法的研究进展及影响其保存的因素

8.1胚胎冷冻保存方法的研究进展

8.2冷冻保护剂的影响

第二章奶牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2方法

1.3试验设计

1.4统计分析

2结果

2.1不同基础液对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果

2.2牛GV期、MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻后发育效果

2.3不同颗粒细胞层数的牛卵母细胞玻璃化冷冻效果

2.4不同的冷冻溶液对OPS法冷冻牛GV期卵母细胞效果

2.5不同的冷冻溶液对GMP法冷冻牛GV期卵母细胞效果

2.6不同承载载体冷冻牛GV期卵母细胞效果

2.7不同解冻程序对冻后的牛卵母细胞发育效果

3讨论

3.1不同基础液的牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果

3.2不同发育阶段牛卵母细胞玻璃化冷冻效果

3.3牛卵母细胞所带颗粒细胞多少的玻璃化冷冻效果

3.4不同的冷冻溶液对OPS法冷冻牛GV期卵母细胞体外发育的影响

3.5不同的冷冻溶液对GMP法冷冻牛GV期卵母细胞体外发育的影响

3.6 OPS法和GMP法对牛GV期卵母细胞体外发育的影响

3.7解冻程序对冷冻的牛卵母细胞发育的影响

第三章奶牛胚胎程序化法冷冻-解冻移植试验

1材料与方法

1.1供体牛和胚胎来源

1.2三步法和一步细管法制作及冷冻

1.3受体牛的选择

1.4解冻胚胎的鉴定

1.5解冻移植

1.6统计分析

2.结果

3讨论

3.1抗冻剂和脱毒剂的选择

3.2一步细管法和三步法冷冻胚胎移植效果

第四章总结论

致谢

参考文献

附图

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