山羊胚胎程序化和玻璃化冷冻应用比较及自行配制玻璃化冷冻液的研究

摘要

家畜胚胎冷冻技术的发展与应用,为良种个体的扩繁和跨区域引种创造了条件，也为优良种质资源的保存提供了更为经济的新手段。目前的问题在于程序化冷冻和玻璃化冷冻，究竟哪种方法更适宜在生产上推广使用。 本文采用了波尔山羊胚胎进行试验研究，超排波尔山羊优秀个体9只，其中有效超排7只，获得可用胚胎108枚，全部进行玻璃化冻存。随后在生产现场解冻其中9枚胚胎，移植给5只受体，其中3只妊娠受体出生5只羔羊；另程序化冷冻胚胎均是从澳大利亚进口的国际贸易标准程序化冷冻胚胎，同步解冻104枚，移植受体78只，共48只妊娠，其中有43只妊娠母羊生羔羊55只，玻璃化冷冻的产羔率明显高于程序化冷冻。研究表明，玻璃化快速冷冻试剂组与程序化冷冻胚胎的移植效果差异不显著，玻璃化冷冻稍具优势。综合考虑，认为玻璃化快速冷冻更适宜在生产推广应用。 商品化的玻璃化冷冻液套装均为进口产品，规格小且价格昂贵，只有大型的优质原种场才有能力负担，因此配制出合适的玻璃化冷冻套装势在必行。通过查阅文献以及多次试验得出一个相对合适的冷冻液配制方法：基础液为DPBS+20%血清，平衡液为7.5%EG（乙二醇）+7.5%DMSO（二甲基亚砜），冷冻液为15%EG+15%DMSO+0.5mol/L蔗糖，解冻液依次为添加1.0mol/L蔗糖、0.5mol/L蔗糖、0.25mol/L蔗糖以及不添加其他物质的基础液。通过冷冻昆明白小鼠GV期卵母细胞，解冻后统计复苏率和卵母细胞的成熟率来检测冷冻液的可行性。研究结果表明，卵母细胞正常培养从GV期发育到MⅡ，成熟率为79.6%（156/196），当使用cryotech商品化冷冻套装进行冻融后其复苏率为92.9%(26/28)，成熟率为78.5%(22/28)，当使用自行配制的冷冻液时，经历冷冻复苏后其复苏率为91.4%（128/140）,成熟率为75.7%（106/140）。对比分析发现，自制玻璃化冷冻套装冷冻效果良好，可用于专业技术人员的培训和在生产中应用推广。

目录

声明

第一章 胚胎和卵母细胞冷冻的研究进展

1.1.1 程序化冷冻

1.1.2 玻璃化冷冻

1.2 影响冷冻效果的因素

1.2.1 物种对冷冻效果的影响

1.2.2 胚胎来源对冷冻效果的影响

1.2.3 卵母细胞和胚胎发育不同阶段对冷冻效果的影响

1.2.4 冷冻保护剂对冷冻效果的影响

1.2.5冷冻速度对冷冻效果的影响

1.3.1 人类胚胎及卵母细胞冷冻的意义

1.3.2 家畜胚胎及卵母细胞冷冻的意义

1.3.3 濒危动物胚胎及卵母细胞冷冻的意义

第二章 山羊胚胎程序化冷冻和玻璃化冷冻比较

2.1 材料

2.1.1 试验动物

2.1.2 试验试剂与耗材

2.1.3 试验仪器

2.2 方法

2.2.1 小鼠二细胞期胚胎的采集

2.2.2 波尔山羊胚胎的采集

2.2.3 程序化冷冻及复苏

2.2.4 玻璃化冷冻及复苏

2.2.5 山羊胚胎移植

2.3 结果

2.3.1小鼠胚胎玻璃化冷冻及复苏后与正常的胚胎发育情况

2.3.2波尔山羊胚胎冻融后发育情况

2.3.3波尔山羊冷冻胚胎复苏后移植妊娠结果

2.4 讨论

2.4.1 提高陕西省波尔山羊良种繁育中心的繁殖潜能

2.4.2 比较程序化冷冻和玻璃化冷冻在生产应用中的差异

2.5 小结

第三章 玻璃化冷冻液的试验比较

3.1.1 试验动物

3.1.2 试剂与耗材

3.1.3 试验器材

3.2试验方法

3.2.1 卵母细胞的采集

3.2.2 卵母细胞的冷冻和解冻

3.2.3 冷冻液套装的配制

3.3.1 自制冷冻液冷冻与复苏过程中卵母细胞状态良好

3.3.2 自制冷冻液冷冻结果对比分析

3.4 讨论

3.4.1玻璃化冷冻液配制的探索以降低冷冻成本

3.4.2小鼠卵母细胞是检测冷冻试剂及过程的最佳模型

3.5 小结

全文结论

参考文献

致谢

个人简历