倍半萜内酯类抗癌小分子药物的初步研究

摘要

化疗是癌症治疗的重要手段，然而，化疗药的高毒副作用和耐药性是亟待解决的问题，来源于天然产物的药物具有高效低毒的特性，为人类探索新型抗癌药提供了源泉。本课题研究了倍半萜内酯-小白菊内酯(PTL)及其类似物的抗癌作用。
　　PTL类似物的抗癌活性研究。通过MTT法初筛了PTL类似物对HL-60、HL-60/ADR、KG1a细胞的增殖抑制作用。利用流式细胞仪探讨对白血病干细胞的靶向杀伤作用。结果显示，部分类似物对HL-60、HL-60/ADR、KG1a有较好的杀伤活性，部分显示对HL-60的活性强于对HL-60/ADR的活性，一小部分没有活性。其中PTL类似物含笑内酯(MCL)有较好的靶向杀伤白血病干细胞的作用。
　　PTL诱导耐药白血病K562/ADR细胞凋亡的机制研究。MTT法及LDH释放法检测PTL对K562和K562/ADR细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内活性氧(ROS)的变化，Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9的表达变化。PTL抑制K562/ADR细胞的增殖，呈剂量依赖，10μmol/LPTL作用24h诱导K562/ADR细胞凋亡，其IC50值及凋亡率与K562细胞相比无显著性差异(P＞0.05)。经10μmol/LPTL处理1h，K562/ADR细胞内ROS增加;处理24h，Bcl-2与Bax的比值降低、caspase-3、caspase-9酶源蛋白表达降低。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞，能抑制细胞ROS水平升高和细胞凋亡。PTL诱导凋亡的作用机制与其刺激细胞内ROS升高相关。
　　含笑内酯(MCL)抑制实体瘤细胞系增殖以及其与阿霉素(ADR)联合用药的研究。通过MTT法检测杀伤活性，流式细胞术法检测细胞周期的分布和细胞凋亡率。结果显示，MCL能够抑制实体瘤细胞系增殖，IC50值的剂量处理细胞24h，SY5Y、SK-OV-3细胞周期被阻滞在G2/M期，对A549和CACO-2的周期没有影响。10μmol/L的MCL与(0.5-8)μmol/L的ADR有较显著的联合作用。10μmol/LMCL与2μmol/L的ADR联合用药，能显著提高对HL-60/ADR的凋亡率，并呈时间依赖性，与单药相比，P＜0.05，具有显著性差异。

目录

声明

摘要

主要符号表

1 前言

1．1 研究背景

1．2 小白菊内酯的药理作用研究现状

1．2．1 小白菊内酯的抑瘤作用

1．2．2 小白菊内酯诱导肿瘤细胞内ROS水平升高

1．2．3 PTL的抗炎作用

1．2．4 促进肿瘤细胞的凋亡

1．2．5 小白菊内酯抑制信号传导与转录激活因子(STAT)活性

1．2．6 抑制微管的形成

1．2．7 阻断细胞周期的分化

1．2．8 靶向肿瘤干细胞

1．2．9 促进白血病细胞向正常细胞分化

1．2．10 PTL做为可卡因的拮抗剂

1．2．11 小白菊内酯的一期临床试验

1．3 药物活性筛选的概况

1．3．1 细胞水平筛选抗肿瘤药物

1．3．2 端粒酶活性为作用靶点的筛选方法

1．3．3 DNA拓扑异构酶为靶点的筛选

1．3．4 作用于微管蛋白的筛选方法

1．3．5 利用调控细胞信号传导通路的筛选方法

1．3．6 抑制肿瘤新生血管生成的筛选方法

1．3．7 天然药物诱导细胞分化的筛选

1．3．8 靶向细胞周期信号蛋白的筛选

1．3．9 肿瘤干细胞的筛选方法

1．4 肿瘤细胞凋亡的机制

1．4．1 凋亡与肿瘤形成

1．5 肿瘤细胞耐药的机制

1．6 理论和应用方面的意义

2 材料与方法

2．1 细胞系

2．2 主要试剂和仪器

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．3 主要溶液的配制

2．4 基本操作

2．4．1 细胞培养的方法

2．4．2 常用的细胞活性测定方法

2．5 实验步骤

2．5．1 MTT法

2．5．2 LDH释放实验检测药物的细胞毒作用

2．5．3 细胞凋亡分析检测药物对细胞凋亡的作用

2．5．4 白血病干细胞的体外杀伤实验

2．5．5 ROS水平检测

2．5．6 Western blot法

2．5．7 细胞周期的测定方法

2．5．8 联合用药方案

3 结果与讨论

3．1 PTL类似物活性筛选结果

3．1．1 PTL及其类似物对HL-60、HL-60／ADR的增殖抑制作用

3．1．2 PTL及其类似物对KG1a的增殖抑制作用

3．1．3 部分类似物对病人干细胞的杀伤作用

3．2 小白菊内酯诱导耐药白血病细胞K562／ADR凋亡的结果

3．2．1 PTL对K562／ADR的增殖抑制作用

3．2．2 PTL对K562／ADR的细胞毒作用

3．2．3 PTL诱导细胞凋亡率的测定

3．2．4 PTL对K562／ADR细胞内ROS的影响

3．2．5 PTL诱导K562／ADR细胞内caspase-3、9蛋白的活化以及下调Bcl-2蛋白的表达

3．3 MCL对实体瘤细胞系的杀伤作用

3．3．1 MCL抑制实体瘤细胞系的增殖

3．3．2 MCL对实体瘤细胞的周期阻滞

3．4 MCL与ADR的联合用药

3．4．1 联合用药对HL-60／ADR细胞的增殖抑制作用

3．4．2 联合用药诱导细胞凋亡率的测定

4 结论

5 展望

参考文献

7 论文发表情况

致谢