马奶酒样乳杆菌ZW3(CGMCC2809)WANG_1297基因的克隆、表达与功能研究

摘要

乳酸菌是公认安全的食品级微生物，胞外多糖(EPS)是其重要的次生代谢产物，研究发现，乳酸菌胞外多糖有很多保健功能。乳酸菌胞外多糖产量一般来说都比较低，限制了其工业化生产及应用，如何提高乳酸菌胞外多糖产量是国内外研究的一个热点，而对于产糖机理的研究正是提高胞外多糖产量的关键。
　　本实验室对马奶酒样乳杆菌ZW3进行了全基因组测序工作，分析得到一段14.4kb的胞外多糖合成基因簇，包含17个与胞外多糖合成相关的基因WANG_1283～WANG_1299，分别编码多糖合成调节基因、聚合基因、糖基转移酶基因等。通过半定量RT-PCR实验，对EPS基因簇各基因的表达量进行分析，得出以下结果。
　　WANG_1283、WANG_1285、WANG_1293三个基因在选取的六个时间点表达量变化不大;WANG_1284、WANG_1286、WANG_1287、WANG_1288、WANG_1290、WANG_1291、WANG_1292、WANG_1294、WANG_1296、WANG_1297、WANG_1298、WANG_1299这十二个基因在菌体生长的50h、60 h（产糖量上升阶段）表达量最高，推测这些基因在多糖聚合过程中起作用;基因WANG_1289随着菌体生长时间表达量持续升高，在菌体生长的80 h（产糖后期）表达量最高，推测其在胞外多糖合成后期起作用;基因WANG_1295在开始10h即有大量表达，30h有所下降，到50～72h表达量维持在较高水平，到80 h又有所下降，呈现出表达量的高低变化。
　　本实验从EPS基因簇中选取一个在菌体生长过程中表达量变化明显的基因WANG_1297作为研究对象，深入探讨WANG_1297基因在胞外多糖合成中的功能。生物信息学分析表明，WANG_1297编码的蛋白属于Fer4_NifH蛋白超家族，具有ATP结合结构域，同时还有eps_fam多功能位点，这些基因位点与荚膜多糖的生物合成相关，跨膜结构预测表明，该基因编码蛋白为胞内蛋白;通过实时荧光定量PCR实验，得出其在多糖合成旺盛阶段表达量最高;在大肠杆菌中成功克隆、表达了WANG_1297蛋白，通过酶联免疫实验，得出该蛋白并没有酪氨酸蛋白激酶活性，推测其是通过结合多糖复合物而实现多糖链聚合。
　　综上所述，WANG_1297蛋白没有酪氨酸蛋白激酶活性，很可能是通过参与多糖复合物的形成来负责多糖链的聚合。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 开菲尔粒及乳酸菌

1．1．1 开菲尔粒与雪莲菌

1．1．2 开菲尔粒的菌相分布

1．1．3 开菲尔粒中的乳酸菌

1．2 乳酸菌胞外多糖

1．2．1 胞外多糖的生理功能

1．2．2 胞外多糖的生物合成

1．3 马奶酒样乳杆菌及其胞外多糖研究概况

1．3．1 马奶酒样乳杆菌基本特征

1．3．2 马奶酒样乳杆菌胞外多糖

1．3．3 马奶酒样乳杆菌ZW3

1．4 本论文研究目的、意义及主要内容

1．4．1 本论文研究目的、意义

1．4．2 本论文主要研究内容

1．4．3 主要技术路线图

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种、质粒及引物

2．1．2 试剂

2．1．3 工具酶及DNA、蛋白质Marker

2．1．4 抗生素

2．1．5 主要仪器及设备

2．1．6 培养基

2．1．7 标准溶液的配制

2．2 试验方法

2．2．1 EPS基因的半定量RT-PCR分析

2．2．2 基因WANG_1297编码的蛋白生物信息学分析

2．2．3 基因WANG_1297的实时荧光定量PCR

2．2．4 基因WANG_1297在大肠杆菌中表达

2．2．5 WANG_1297编码蛋白功能测定

3 结果与讨论

3．1 EPS基因半定量RT-PCR结果

3．1．1 产糖曲线测定

3．1．2 半定量RT-PCR结果

3．2 基因WANG_1297的蛋白生物信息学分析

3．2．1 同源性搜索与分析

3．2．2 WANG_1297蛋白的理化特性分析

3．2．3 WANG_1297蛋白保守功能区分析

3．2．4 WANG_1297蛋白空间结构预测

3．2．5 WANG_1297蛋白跨膜结构域分析

3．2．6 WANG_1297信号肽分析

3．3 基因WANG_1297的表达量分析

3．3．1 基因WANG_1297的荧光定量PCR结果

3．3．2 实时荧光定量PCR的特异性验证

3．4 WANG_1297基因在大肠杆菌中的表达

3．4．1 WANG_1297基因的扩增

3．4．2 重组质粒的快提验证结果

3．4．3 重组质粒测序结果

3．4．4 重组蛋白表达

3．4．6 蛋白活性测定

4 结论

4．1 EPS基因簇基因的半定量分析

4．2 WANG_1297蛋白生物信息学分析

4．3 WANG_1297基因的实时荧光定量PCR分析

4．4 WANG_1297基因在大肠杆菌中的表达

5 展望

参考文献

致谢

附录