基于胚系mRNA异常筛选遗传性非息肉病性结直肠癌家系的研究

摘要

遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是一种常染色体显性遗传性恶性肿瘤综合征，外显率高达80％～90％，占所有结直肠癌的2％～15％。HNPCC与散发性结直肠癌相比，在发病机制上、临床表现上以及治疗方案的选择和随访方案的制定上均不尽相同，将两者区分开来不仅具有实际的临床意义，而且有利于遗传学咨询，其已被许多国家重视，欧美发达国家、韩国、日本等成立了完善的登记和分析机构，并进行了深入的分子遗传学研究。为了在国际间更好地研究HNPCC，1989年成立了HNPCC国际合作小组(InternationalCollaborativeGrouponHereditaryNonpolyposisColorectalCancer，ICG—HNPCC)。自1990年以来，Amsterdam标准(工、II)、日本标准、Bethesda指导纲要等筛选HNPCC家系的临床标准相继被提出。然而，HNPCC的确诊有赖于错配修复(mismatchrepair，MMR)基因的胚系病理性突变的检出。大量的研究资料表明，在世界范围内与HNPCC相关的MMR基因突变位点分布广泛，缺少突变热点。我国人群MMR基因的突变谱系如何?有相关突变热点吗?相关的报道甚少。结直肠癌已是我国最常见的恶性肿瘤之一，并有逐年上升的趋势，目前已成为女性第二位、男性第三位高发恶性肿瘤，再之，我国是一个实行计划生育的国家，家系的正变得越来越小，HNPCC的家族倾向变得也越来越不明显，所以在我国进行该领域的系统研究必要而紧迫。本研究共分以下三部分，分别报告如下： 第一部分基于外周血mRNA的MLH1和MSH2基因胚系突变检测 目的：1．在国内建立一种利用耐热性逆转录酶和特异引物、基于外周血mRNA异常诊断HNPCC家系方法；2．探讨中国人群HNPCC家系的MLHl和MS＃2基因胚系突变类型和谱系。 方法：收集符合Amsterdam标准(包括I、II)家系19个、日本标准¨个、Bethesda指导纲要29个共1.00个家系成员外周血标本，提取mRNA和DNA；利用耐热性逆转录酶和MLHl、MSH2特异引物，特异地逆转录该两基因的mRNA；PCR扩增逆转录产物(cDNA)；测序分析PCR产物；利用基于基因组DNA的扩增测序，验证基于mRNA扩增测序检出的部分新突变。 结果：在59个HNPCC的临床家系中，17个家系被检出MLHl和MSH2胚系突变，家系的总突变率为28．8％，分布于15个位点上，其中9个MLHJ突变(60％，9／15)，6个MSH2突变(40％，6／15)。6个是已报道的病理性突变，9个是尚未报道的新突变。突变的类型包括错义突变(10个)、终止密码子突变(1个)、移码突变(1个)、同义突变(2个)和非编码区突变(1个)。MLHl的突变分别分布于外显子2(2个)、8(1个)、12(2个)、16(2个)、4(1个)和外显子19(1个)，其中两家系的突变位于12外显子的同一位点上。MSH2的突变分别分布于外显子1(1个)、2(1个)、3(1个)、7(1个)、12(1个)和外显子13(1个)，其中两家系的突变位于3外显子的同一位点上。 结论：1．基于外周血mRNA的基因测序方法能检测出MMR基因的胚系突变，与基于基因组DNA测序方法相比，成本较低。2．ML＃I基因的胚系突变率略高于MSH2者。3．在中国人群中，与HNPCC相关的MMR基因胚系突变类型可能以错义突变为主。4．Amsterdam标准对HNPCC预示的阳性率高于日本标准；日本标准对HNPCC预示的阳性率高于Bethesda指导纲要。5．ML＃I基因的第2、12、16外显子和MSH2基因的第3外显子可能是中国人群的高突变外显子。 第二部分JtLHl和MSH2胚系新错义突变功能性的初步评价 目的：1．评价2个MLHl新错义突变和3个MSH2新错义突变的功能性。2．判断有新错义突变的家系是否是HNPCC家系。 方法：整理新突变家系的患病谱系，收集新突变患者肿瘤组织，使用一组国际HNPCC合作小组推荐的5个微卫星位点，包括单核苷重复序列BAT25、BAT26和双核苷重复序列D2S123、D5S346和D17S250，PCR扩增产物经ABI3lODNA自动分析仪检测，以各患者外周血标本作为内对照，利用Genescan软件分析判断微卫星不稳定(microsatel¨teinstability，MSI)状态。利用Envision免疫组化(immunohistiochemistry，IHC)法检测MLHl和MSH2蛋白的表达情况；以肿瘤组织间质细胞和浸润的淋巴细胞为对照。将MSI、IHC结果和各患者家系的临床资料相结合，综合评价各突变的功能性。 结果：1．家系资料：本研究6家系共有患者20人，平均初发最年轻年龄为36．7岁，有多原发癌者3人，右半结肠癌8个(44．4％，8／18)，左半结肠癌lO个(63．6％，10／18)。2．MSI检测结果：在检测的6个家系患者中，1个患者的肿瘤组织在全部5个微卫星点上出现新生峰，3个患者的肿瘤组织分别有4个微卫星点出现新生峰，2个患者的肿瘤组织分别在3个微卫星点上出现新生峰；在5个微卫星点上，6个患者的外周血对照DNA均未出现新生峰。根据微卫星不稳定性的判断标准，该6个患者的肿瘤组织均呈高度微卫星不稳定性。3．IHC检测结果：在检测的6患者肿瘤组织中，癌旁的腺体、间质纤维细胞、浸润的淋巴细胞等非肿瘤成分均呈MLHl和MSH2蛋白染色阳性。两蛋白在癌旁腺体的表达主要定位于腺窝以下的腺上皮的细胞核上。问质的纤维细胞和浸润的淋巴细胞较弥漫的核阳性。有MLHl突变的2患者MLHl蛋白1个患者失表达，另1患者弱表达，而MSH2蛋白表达正常。有MSH2突变的4患者MSH2蛋白均失表达，而MLHl蛋白表达正常。MLttl、MSH2基因突变与其蛋白异常表达符合率均为100％(6／6)。 结论：6家系的5个突变均有功能改变，为病理性，即：MLttl第12外显子、412密码子缬氨酸→甘氨酸突变、第16外显子、581密码子的脯氨酸→亮氨酸突变以及MSH2第3外显子、127密码子的天冬酰氨→组氨酸突变、第7外显子、367密码子的缬氨酸→甘氨酸突变和第13外显子、646密码子的苏氨酸→精氨酸突变均为病理性。该6家系均为HNPCC家系。 第三部分HNPCC临床家系外周血ML肌基因mRNA的定量分析 目的：1．探讨符合不同标准的HNPCC临床家系外周血MLHl基因mRNA量的表达情况。2．建立一种基于外周血新的分子筛选HNPCC家系的方法。 方法：1．标本准备：收集与本研究第一部分相同家系成员的外周血标本，提取各成员的总RNA。2．逆转录：利用耐热性逆转录酶和随机引物，逆转录各成员的RNA。3．利用MLHlTaqMan荧光探针和特异引物进行实时荧光定量PCR扩增逆转录产物(cDNA)；以保守基因TAMRA作为对照；荧光定量检测结果采用opticonmonitor1．07软件进行分析。4．将每一标本所得MLH1基因拷贝数与其相对应的HBA2基因拷贝数相除来校正不同标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异，得出MLHl基因相对表达量；比较符合不同HNPCC临床家系MLHl基因mRNA的表达差异；在符合Amsterdam标准家系间，比较有突变和无突变家系MLHl基因mRNA的表达差异。 结果：1．各成员MLH!基因的mRNA的相对表达量用MLHl／YB,42~105表示。在符合Amsterdam标准的家系中ML＃i基因的mRNA相对表达量为2．98×10-6～64．32，平均值为10．91；在符合日本标准的家系中相对表达量为7．14×10～13．56，平均值为1．74；在符合Bethesda指导纲要的家系中相对表达量为6．25×10～44．14，平均值为4．17。2．在符合Amsterdam标准的临床家系，有突变和无突变成员的MLHl基因mRNA相对表达量有显著性差异(P0．05)。 结论：1．TaqMan实时荧光定量PCR技术能用于ML＃i基因的mRNA定量分析。2．在有突变的成员和无突变的成员间，ML＃I基因的mRNA表达量很可能存在着显著性差异。3．在符合Amsterdam标准、日本标准和Bethesda指导纲要家系间，MLHl基因的mRNA的表达量很可能没有显著性差异。

目录

引言

第一部分 基于外周血mRNA的MLH1和MSH2胚系突变检测 材料和方法

第一部分 基于外周血mRNA的MLH1和MSH2胚系突变检测 结果

第一部分 基于外周血mRNA的MLH1和MSH2胚系突变检测 讨论

第一部分 基于外周血mRNA的MLH1和MSH2胚系突变检测 小结

第二部分 MLH1和MSH2基因胚系新错义突变功能性的初步评价 材料和方法

第二部分 MLH1和MSH2基因胚系新错义突变功能性的初步评价 结果

第二部分 MLH1和MSH2基因胚系新错义突变功能性的初步评价 讨论

第二部分 MLH1和MSH2基因胚系新错义突变功能性的初步评价 小结

第三部分 HNPCC临床家系外周血MLH1基因mRNA的定量分析 材料和方法

第三部分 HNPCC临床家系外周血MLH1基因mRNA的定量分析 结果

第三部分 HNPCC临床家系外周血MLH1基因mRNA的定量分析 讨论

第三部分 HNPCC临床家系外周血MLH1基因mRNA的定量分析 小结

总结

参考文献

附录攻读博士学位期间发表及待发表的论文题录

遗传性非息肉病结直肠癌的研究进展

致谢

缩略语索引

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