经宫颈的胎儿滋养细胞应用于孕早期产前诊断的初步探讨

摘要

迄今为止，孕早期获得胎儿细胞进行产前诊断的方法大体上分为两类：创伤性及非创伤性技术。创伤性的产前诊断方法主要有羊膜腔穿刺法(amniocentesis，AC)及胎儿绒毛取样法(chorionicvilloussampling，CVS)，这两种方法都可能对胎儿造成一定的危害，甚至流产。因此，近十几年来，无创伤性或微创性孕早期的产前诊断越来越受到广泛的关注。1971年，Settles首次在孕早期的宫颈粘液中找到蜕化脱落的胎儿绒毛细胞，成功地进行了性别的诊断。这种利用经宫颈获取胎儿滋养细胞(tanscervicalcollection，TCC)，有可能成为一种新的、具有临床应用价值的孕早期性连锁及染色体异常遗传病的产前诊断方法。由于取材方法和检测技术的不同，使胎儿细胞的检出率有很大差别，对最佳的取材部位及取材时间结论也不尽相同。因此本课题旨在对经宫颈获取的胎儿滋养细胞应用于孕早期性连锁遗传病产前诊断的可行性进行研究，并对其方法学以及某些影响因素作初步的探讨。 第一部分孕早期经宫颈获取胎儿滋养细胞进行产前诊断的可行性研究 目的：探讨经宫颈获取胎儿细胞应用于孕早期产前诊断的可行性。 方法：收集孕6.10周行人工流产手术妇女的经宫颈冲洗液，所有样本分为两份。一份行苏木精伊红染色和CK7的细胞免疫化学染色，观察胎儿滋养细胞获取率；另一份抽提DNA，对X染色体的凝血因子Ⅷ和Y染色体的SRY基因进行扩增。人流后的绒毛采用直接法分析染色体核型确定流产胎儿性别，并与PCR结果相比较。 结果：20份经宫颈冲洗的样本中，用苏木精伊红常规染色和CK7的细胞免疫化学染色，只有4例检测出胎儿的滋养细胞，仅占20﹪；利用PCR检测出7／12名(58．3﹪)男胎的SRY基因，而8名女胎的SRY基因均未检测出。 结论：孕早期经颈管能获取到胎儿的滋养细胞，可以为性别连锁及单基因遗传病提供了一个早期、非创伤性产前诊断的方法。但应该采用更加特异的抗滋养细胞抗体和更灵敏的PCR技术，以提高滋养细胞的检出率。 第二部分：利用实时定!ilPCR比较不同部位的经宫颈获取的胎儿细胞量 目的：利用实时定量PCR方法对经宫颈不同部位获取的胎儿细胞进行检测，确定更佳的取材部位，初步建立一套孕早期检测伴性遗传病的产前诊断方法。方法分别收集孕6.10周人工流产妇女的经宫颈内口和宫颈外口冲洗液各60例，提取DNA，对Y染色体的SRY基因进行扩增和定量。人流后的绒毛采用直接法分析染色体核型确定流产胎儿性别。 结果：(1)经宫颈内口冲洗组，实时定量PCR检测出15／21例(71.4﹪)已知男胎的SRY基因，2／39例已知女胎的SRY基因；经宫颈外口冲洗组，实时定量PCR检测10／27例(37﹪)已知男胎的SRY基因,2／32例已知女胎的SRY基因。经宫颈内口冲洗组的总性别正确预测率和男胎阳性率均显著高于经宫颈外口冲洗组(86.7﹪vs67．8﹪，P<0．05；71.4﹪Vs37﹪，P<0．05)。Q)实时定量PCR检测经宫颈内口冲洗组SRY基因的拷贝数显著高于经宫颈外口冲洗组(1487．17+430．45拷贝vs702.414-365．71拷贝,P<0．05)。 结论：经宫颈获取胎儿细胞为孕早期无创性产前诊断提供了一个可能途径，经宫颈内口水平能比外口得到更多的胎儿细胞，但应采取更加安全有效的取材方法。 第三部分：利用实时定量PCR比较两种经宫颈获取胎儿滋养细胞的方法 目的：采用实时定量PCR方法对经宫颈冲洗和粘液抽吸获取的胎儿细胞进行定性定量分析，比较两种取材方法的优越性。 方法：分别收集孕6.10周人工流产妇女的经宫颈冲洗液和抽吸粘液各60例，提取宫颈分泌物中DNA，对Y染色体的SRY基因进行扩增和定量。人流后的绒毛采用直接法分析染色体核型确定流产胎儿性别。 结果：(1)经颈管冲洗组，实时定量PCR检测出15／21例(71.4﹪)已知男胎的SRY基因，2／39例已知女胎的SRY基因；经宫颈粘液抽吸组，实时定量PCR检测21／24名(87.5﹪)已知男胎的SRY基因,6／33例已知女胎的SRY基因。两组的总性别正确预测率和男胎阳性率无统计学差异(86.7﹪vs84.2﹪，P<0．05；71.4﹪v87.5﹪，P<0．05)。(2)实时定量PCR检测经宫颈粘液抽吸组的SRY基因拷贝数显著高于经宫颈内口冲洗组(5183.83+1976.03拷贝vs1487．174-430．45拷贝,P<0．05)。 结论：经宫颈获取的胎儿细胞可以应用于非创伤性产前诊断，经颈管抽吸粘液法能比经颈管冲洗法得到更多的胎儿细胞。

目录

论文独创性声明及论文使用授权声明

前言

第一部分 孕早期经宫颈获取胎儿滋养细胞进行产前诊断的可行性研究

资料和方法

结果

讨论

第二部分 利用经宫颈不同部位的胎儿细胞进行产前诊断的初步研究

资料和方法

结果

讨论

第三部分 利用实时定量PCR比较两种经宫颈获取胎儿滋养细胞的方法

材料和方法

结果

讨论

全文小节

参考文献

致谢