多重荧光PCR检测产vero毒素大肠杆菌（VTEC）方法的研究及初步应用

摘要

产Vero毒素大肠埃希氏菌(Vcrocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC)，又称产类志贺氏菌毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin-producingEscherichia coli，SLTEC)，是指能够产生对Vero细胞和Hela细胞有毒性的VT1、VT2及VT1、VT2变异毒素的一群大肠埃希氏菌。 该类菌主要通过食物传播，动物产品有可能是感染人类的主要来源。能引起任何动物的溶血性尿毒综合症(HUS)、出血性结肠炎(HC)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重疾病。目前世界上许多发达国家和一部分发展中国家都发生过VTEC的暴发流行，成为全球性的公共卫生问题。新加坡官方已明确要求，所有对新进口的肉食品必须检测VTEC，因此建立快速准确的诊断方法已成为动物产品检疫的迫切要求。 实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术，在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测，具有极大的应用价值。本研究中依据SYBR Green I能和双链DNA结合的特性，根据VT1和VT2毒素基因的保守性分别设计一对引物，进行多重荧光PCR反应，从而为出口肉食品检测和临床诊断提供有力的依据。本课题分两部分进行研究。 试验一产vero毒素大肠杆菌(VTEC)多重荧光PCR检测方法的建立该研究的目的是通过比较Genbank中已发表的VT基因序列的同源性，设计特异性引物，利用该引物进行PCR扩增，结果只有以VTEC的DNA为模板可以扩增出95bp和108bp的特异条带。利用SYBR Green I能和双链DNA结合的特性，通过对试验条件的优化，实现了对VTEC的实时荧光PCR检测。试验中能够检出液体样品中的VTEC细菌数量可达10cfu/mL。试验结果表明建立的SYBR Green I实时荧光PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求。 试验二VTEC多重荧光PCR法在VTEC快速检测中的应用应用试验一建立的方法检测样品，样品来源有两部分，一部分是模拟阳性样品，另一部分是实际采集样品。并且依此来验证该方法在实际检测中的灵敏度和适用性。结果表明，该方法采用6h的增菌培养后，进行荧光PCR检测，能够检测到原始样品中VTEC最低量可以达到10cfu/g，适合于出口肉食品检测和临床快速诊断。

目录

论文说明：缩略语英汉对照表

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摘要

引言

1.VTEC及检测方法的研究进展

1.1病原学研究

1.2VTEC的流行病学研究

1.3VTEC的诊断方法的研究

2.实时定量PCR研究进展

2.1荧光染料

2.2 TaqMan探针

2.3 Amplisensor(Biotronics)

2.4 Molecular beacon

2.5 Lightcycler

2.6复合探针法(complex probes)

2.7Taqman-MB荧光探针定量PCR技术

2.8荧光双链引物法

2.9通用探针法

2.10荧光引物法

研究部分

试验一产vero毒素大肠杆菌(VTEC)多重荧光PCR检测方法的建立

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

试验二多重荧光PCR法在VTEC快速检测中的应用

1模拟样品的检测

2出口企业养殖场、屠宰场抽样调查检测

结论

参考文献

致谢

个人简介及硕士期间发表论文