ITP患者IgG酶切片段的免疫活性及其对血小板聚集功能的影响

摘要

血栓性疾病是影响人类健康的重大疾病之一，其国内发病率逐年上升，防止血栓形成是当代医学研究的重点和热点。血栓形成与血管内皮损伤、抗凝和纤溶活性降低、血流淤滞等因素有关，而血小板的粘附、聚集、释放是动脉血栓形成的重要环节。因此，抗血小板治疗是防治血栓性疾病的主要手段。 血小板是来源于巨核细胞的小的、无核血细胞，是损伤后形成血栓修复损伤组织和止血的第一道防线。然而，血小板的不适当活化也可导致血栓形成、心梗和中风。血小板还能在冠状动脉和颈动脉等处形成动脉硬化，激发血栓形成。血小板表面有许多重要的膜糖蛋白(glycoprotein，GP)，它们各自功能不同而又相互联系，比较重要的有GPIIb/Ⅲa、GPIb/IX、GPVI和GPIa/lla等，分别参与血小板粘附、聚集、释放的不同阶段。如GPIIb/Ⅲa是纤维蛋白原受体，纤维蛋白原和激活的GPIIb/Ⅲa．结合是血小板聚集的最后共同通路。GPIb/IX作为vWF的受体，是介导血小板与内皮下vWF相连的重要成分，是启动血小板粘附、聚集并进而导致血栓形成的首要环节。而作为血小板表面重要胶原受体的GPVI，在胶原诱导的血小板活化和血小板聚集过程中起重要作用。一般认为血小板聚集的主要模式为：血小板的粘附主要由GPIb/IX启动，GPVI则通过GPVI-FcR γ复合物介导血小板粘附后的信号传导和活化，上调整合素GPIIb/Ⅲa的亲合力，使GPIIb/Ⅲa能与纤维蛋白原等配基连接，导致血小板聚集和释放。目前正研究中的抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体片段，就是通过拮抗血小板表面不同GP的作用而抑制血小板的粘附、聚集、释放，从而防止血栓形成。阿昔单抗(Abciximab,7E3)是人鼠嵌合型抗血小板GPⅡb/Ⅲa的单克隆抗体片段，经大规模临床试验已被广泛用于急性冠状动脉综合征患者及经皮冠状动脉介入治疗，成为临床上高效、特异的抗血小板药物。基因工程抗体AJW200是人源化的抗vWF-A1嵌合Fab抗体，它可以阻断vWF与GPIb的结合，抑制血小板粘附和聚集以及凝血酶的产生，已进入临床试验阶段。抗鼠GPVI单抗JAQl能抑制胶原诱导的血小板聚集，产生GPVI基因剔除样现象。但以上抗体均为鼠源或人鼠嵌合抗体，仍有抗原性，可引起人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)反应。完全人源化血小板功能抗体的研发是克服HAMA的根本途径。 特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是一种自身免疫性疾病，多数患者血浆及血小板表面可测得血小板特异性抗体，与血小板或巨核细胞膜糖蛋白结合后激活单核一巨噬细胞或补体系统，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒或补体依赖的细胞毒作用导致血小板破坏或巨核细胞成熟障碍，引起血小板数量减少或功能障碍。在ITP患者的血小板自身抗体中，虽然可见与血小板反应的IgM和lea抗体，但最常见的自身抗体还属IgG型，并且以IgGl和IgG3亚类最常见。已有研究报道，ITP患者血小板GP特异性IgG自身抗体与其相应抗原结合后大多数引起血小板破坏过多或生成减少，但少数同时影响血小板粘附、聚集功能。基于此，ITP患者中此类能抑制血小板聚集功能的自身抗体是研究人源化血小板功能抗体的宝贵资源。 以往研究表明血小板膜糖蛋白特异性自身抗体具有轻链限制性，呈单克隆或寡克隆起源。血小板自身抗体的克隆限制性特性，提示抗体的单克隆生成，相应GP上存在的自身抗原表位的数量是有限的。受此启发，我们拟从ITP患者血浆中筛选出能与血小板GP特异结合并抑制血小板聚集功能的自身抗体，并利用此类患者的抗体基因，使用噬菌体抗体库技术研制抗血小板GP的新型抗体-基因工程抗体片段(ScFv)，特异地抑制血小板聚集，用于防治血栓性疾病。 本研究应用改良的单克隆抗体特异性俘获血小板抗原技术(monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigens，MAIPA)及体外血小板聚集试验成功筛选出抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ和GPVI自身抗体阳性并能抑制血小板聚集的ITP患者血浆，应用亲和层析技术结合胃蛋白酶消化纯化并制备其IgG及F(ab’)<,2>抗体片段。进一步试验研究表明，IgG的F(ab’)〈,2>片段是血小板自身抗体的功能片段，它既保留了与血小板糖蛋白的结合活性，又具有抑制血小板聚集的能力，为利用噬菌体抗体库技术研制完全人源化血小板功能抗体片段奠定了研究基础，使联合不同作用机制的抗血小板药物能通过拮抗血小板膜糖蛋白的不同环节而抑制血小板的粘附、聚集、释放，达到防止血栓形成的目的。 目的：为利用噬菌体抗体库技术制备完全人源化血小板膜糖蛋白(GP)特异性抗体，筛选ITP患者中能抑制血小板聚集的血小板GPIIb/Ⅲa、GPIb/IX及GPVI特异性IgG抗体并探讨IgG抗体及其酶切片段的免疫活性和功能。 结论： 1．特发性血小板减少性紫癜是一种自身免疫性疾病，血小板膜糖蛋白是携带靶抗原的主要成分。本组48例(57.1％)的患者血浆可检测到血小板GPIIb/Ⅲa和/或GPIb/IX和/或GPVI特异性自身抗体，其中以GPIIb/Ⅲa和GPIb/IX自身抗体最为常见。 2．血小板膜糖蛋白特异性自身抗体多数引起血小板的破坏，只有少数抑制血小板聚集功能。本组中7例(14.6％)自身抗体阳性的ITP患者血浆明显抑制了ADP、瑞斯托霉素或胶原诱导的血小板聚集。 3．SDS-PAGE电泳证实，经蛋白A亲和层析技术结合胃蛋白酶法消化制备并纯化的IgG抗体及其F(ab')<,2>片段，纯度高，效率好。 4．试验证实F(ab’)<,2>片段是IgG自身抗体的功能片段，它不但保留了良好的抗原结合活性且部分可抑制血小板聚集功能，为利用噬菌体抗体库技术制备人源化血小板糖蛋白特异性抗体奠定了基础。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

符号说明

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附图

参考文献

综述一抗血小板人源化抗体的研究进展

综述二血小板膜糖蛋白VI(GPVI)的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文