利用扩增片段酶切分析法检测基因组编辑的同源重组效率

摘要

基因组编辑技术的快速发展，使得人们能够按照意愿对基因组位点进行编辑修饰，实现基因的敲入和敲除。基因组编辑技术能够利用分子生物学手段实现对基因的改造，从而帮助人们深层次地理解基因的内部结构、基因功能与生物表型之间的关系，是进行基因功能研究、转基因动物制备和基因治疗的重要手段。特别是新兴的CRISPR/Cas9技术，以其编辑效率高，制作简单和成本低的特点，已经被广泛应用于斑马鱼，果蝇，小鼠等模式生物和人类细胞中。该技术的快速发展必将给人类疾病治疗和动植物新品种的培育带来革新性的改变。在细胞中，基因组发生双链断裂，细胞启动自身同源重组修复的效率是极低的，而这种低效率的修复不能满足人们对靶位点精确修复的要求。同源重组修复效率的高低跟位点自身以及同源重组片段的大小都有密切的关系。在之前的研究中人们发现：随着同源臂的增大，位点的同源重组效率也是逐渐增加的。本实验以人293T细胞为平台，利用CRISPR/Cas9技术造成基因双链断裂，用不同大小的同源重组片段（250 bp,500 bp,750 bp,1 kb,1.5 kb,2 kb）去重组修复，验证同源片段大小对同源重组效率的影响。结果显示随着同源片段不断增大，同源重组效率也是不断提高的，但是效率增加的幅度并不是均匀的。在一些位点的检测中，我们还发现了同源重组效率随着同源片段大小的增加呈现先减小后增加的趋势。
　　本研究建立了一种能够用分子手段检测同源重组效率的方法-AFDA（amplification fragment digestion analysis），相较于eLIFE上的方法—用200bp的同源片段重组修复，AFDA可以进行任何长度的同源片段的检测，而且我们的实验结果显示小片段的检测结果不具有均一性。对于不同的位点而言，短片段的重组效率不如长片段的重组效率更具可靠性，不能代表该位点的真实重组效率。在HR效率结果检测方法上，本实验采用了三种不同的方法，琼脂糖凝胶电泳检测，聚丙烯酰胺凝胶检测和Agilent生物芯片技术。三种方法都能采用，只是对于效率差别较小的位点，琼脂糖凝胶的分辨率不高。聚丙烯酰胺凝胶的分辨率可以达到要求，但是整个实验耗时较长。相比较之下，Agilent生物芯片有着明显的优势，能够在较短的时间内完成样品分析，具有高效率，高稳定性，高精确性等特点。除此之外，本实验还以自行构建的Cas9稳转细胞系为平台，通过不同类型小分子物质的添加，验证小分子物质对打靶位点的同源重组效率的影响。结果证实两种类型的小分子物质确实能够促进细胞的同源重组修复。总之，本实验提供一种检测HR效率的方法，为高效率靶位点的选取提供了技术支持，为转基因动物制备，基因治疗提供了理论基础。

目录

声明

1. 前言

1.1 基因组编辑技术

1.1.1 锌指核酸酶介导的基因组编辑技术

1.1.2 类转录激活因子核酸酶介导的基因组编辑技术

1.1.3 CRISPR/Cas 系统介导的基因组编辑技术

1.1.4 基因组编辑技术的研究现状及前景

1.2 细胞内两种修复机制

1.2.1 非同源末端连接

1.2.2 同源重组

1.3 检测效率的方法

1.3.1 利用重组底物测量DSBs的末端连接

1.3.2 线性DNA底物再环化法

1.3.3 T7E1酶检测法

1.3.4 Surveyor检测法

1.3.5 高通量测序

1.3.6 高分辨率熔解度曲线

1.3.7 AFDA检测法

1.4 影响同源重组效率的一些因素

1.5 研究内容及目的

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验细胞系

2.1.2 实验主要仪器

2.1.3 实验主要试剂

2.1.4 相关基因及载体

2.1.5 常用培养基及溶液配制

2.1.6 实验相关引物序列

2.1.7 相关软件

2.1.8 打靶位点

2.2 实验方法

2.2.1 载体构建

2.2.2 细胞培养

3. 结果与分析

3.1 载体构建的结果

3.1.1 gRNA三合一载体的构建

3.1.2 不同大小的同源片段的获得

3.2 细胞培养的结果

3.2.1 人293T细胞培养结果

3.2.2 转染3天后细胞结果图

3.3 打靶位点的同源重组效率结果

3.3.1 琼脂糖凝胶结果图

3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶结果图

3.3.3 安捷伦仪器结果

3.3.4 位点的NHEJ琼脂糖凝胶结果

3.3.5 加入小分子物质后位点的检测结果

4. 讨论

4.1 小分子物质对同源重组效率的影响

4.2 两种检测HR效率方法的比较

5. 结论

参考文献

致谢