低转染效率细胞同源重组效率的检测

摘要

基因组编辑技术是利用人工核酸内切酶对特定的目的基因进行修饰和改造，引入DNA片段或造成目的基因缺失的一种技术。目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9系统，该系统能够对目的基因进行高效快捷地改造，实现目的基因的敲入或者敲除，从而定向改变物种的遗传信息。该技术主要应用到探究物种基因的功能及作用机理、构建模式动物、基因治疗等方面。CRISPR/Cas9系统作用到靶位点上会导致DNA双链断裂，导致细胞启动同源重组修复（HDR）或者非同源末端连接修复（NHEJ）。非同源末端连接修复可以引起碱基移码突变，实现基因沉默；而同源重组修复可以实现基因的定向改造。大多数情况下，为了提高实验成功率，在使用CRISPR/Cas9技术对基因定向改造前，需要筛选出高效的靶位点。如今，基因组编辑效率的检测手段有很多种，主要是检测NHEJ效率，而很少有检测HDR效率，但是在很多研究中，对基因组进行修饰主要用的是同源重组修复途径。
　　本研究致力于HDR效率的检测。选取小鼠母源印记Meg3基因作为研究对象，确定该基因位置的10个gRNA位点，用两种细胞系作为受体细胞来检测10个位点同源重组效率。一种是容易培养和转染的293T细胞系，首先将小鼠Meg3基因的3'和5'大小约3kb左右DNA序列扩增出来，然后导入293T细胞的基因组中，以该细胞系作为平台，利用改良后的扩增片段酶切分析（AFDA）检测方法检测10个位点同源重组效率；另一种是小鼠ES细胞，由于ES细胞转染难度大，本课题通过摸索优化ES细胞转染条件，最终确定利用电转染法，电转程序为 A-013，转染细胞数量满足2-4×106个，转染效率能都达到10％-20%，由于该效率还不能达到后续检测要求，我们在Cas9质粒中引入一段绿色荧光蛋白基因，能随Cas9蛋白一起表达而不影响Cas9蛋白作用，然后利用流式细胞仪分选出带绿色荧光的细胞，剔除未转染成功的细胞，间接提高转染效率，最终ES细胞样品转染效率相当于达到90%，同样利用扩增片段酶切分析检测方法检测10个位点的同源重组效率。利用容易培养和转染的293T细胞为受体细胞检测出小鼠Meg3基因10个位点的同源重组效率，筛选出3'-1和5'-4高效率位点，但是293T细胞中的基因环境与小鼠细胞中的基因环境有所不同，可能导致每个靶位点的同源重组效率也会不同，我们又用 ES细胞为受体细胞同样检测这10个位点的同源重组效率，得到结果也是3'-1和5'-4两个位点效率最高，而且两批结果其他靶位点效率高低也基本一致，说明293T细胞基础上检测的结果是可靠的。本实验创造性建立了一种利用易培养易转染细胞系检测难转染少量细胞基因组编辑效率的方法，并证明了该方法的可行性。最终成功筛选得到效率高的靶位点，给以后目的基因的改造、模式生物的构建以及基因治疗提供很好的技术手段。

目录

声明

1 前言

1.1 基因组编辑技术

1.2 细胞DNA双链断裂的两种修复

1.3 基因打靶技术

1.4 检测基因组编辑效率的方法

1.5 印记基因Meg3

1.6 小鼠ES细胞和293T细胞

1.7 细胞转染

1.8 研究的主要内容及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 载体构建

3.2 239T稳转细胞系建立

3.3 239T细胞检测结果

3.4 ES细胞检测结果

4 讨论

4.1 CRISPR/Cas9系统介导的同源重组效率检测

4.2 Meg3基因、ES细胞、293T细胞的选取以及检测方法的建立

5 结论

参考文献

致谢

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