新城疫病毒FMW株体外抗肿瘤作用的初步研究

摘要

溶瘤病毒是近年来肿瘤生物治疗研究的热点之一，到目前为止，国内外已有数十种不同的病毒进入临床实验，包括突变腺病毒(ONYX-015)、单纯疱疹病毒(G207)、人呼肠孤病毒(实验室3型Dearins)、新城疫病毒(PV701)等。作为溶瘤病毒之一的新城疫病毒，不能在人正常细胞中复制，只能在特定肿瘤细胞中增殖，具有较好的安全性。目前研究表明，新城疫病毒溶瘤谱广且副作用轻微。近年来国外有部分新城疫毒株如NDV-HUJ、NDV-73T、MTH68、PV701等作为溶瘤病毒已经分别进入Ⅱ、Ⅲ期临床实验。部分实验结果显示出新城疫病毒在临床肿瘤治疗方面的良好应用前景。我们从近50株新城疫毒株中筛选到一株对人肺癌细胞株A549和肝癌细胞株SMMC7721等肿瘤细胞株都具有较好生长抑制效应的新城疫毒株，命名为NDV-FMW株。该毒株能够激活细胞凋亡信号通路，通过细胞凋亡通路实现溶瘤效果。 方法： L.MTT法筛选对肿瘤细胞株A549、SMMC772l生长增殖具有较好抑制效应的毒株。 2.空斑实验确定病毒滴度及感染复数。 3.光学显微镜观察病毒感染后细胞形态学变化。 4.MTT法、流式细胞术检测技术检测病毒对肿瘤细胞增殖的影响。 5.Hochest33258荧光染色法观察凋亡细胞核内变化。 6.PI单染法、AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡，分析细胞周期分布。 7.Western Blot检测病毒感染肿瘤细胞后凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3、p-JNK、p-AKT、p-P38、p-ERK的表达。 结果 MTT法筛选到一株新城疫毒株，对人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SMMC7721都具有较好的生长抑制效应，命名为NDV-FMW株。不同感染复数(MOI)的病毒作用A549、SMMC772l细胞24小时可见明显形态学变化，细胞变圆，48小时后细胞起泡，内溶物凝集，透光性变差，部分细胞不再贴壁生长而成悬浮状态，72小时后大量细胞悬浮，死亡，产生细胞碎片。MTT法检测该毒株对A549、SMMC772l细胞生长增殖的影响，结果发现该毒株能够显著抑制这两种细胞的生长增殖，20MOI病毒作用48小时后，细胞生长抑制率达到60％以上。我们进一步采用流式细胞术方法检测该毒株对细胞的杀伤作用，证实抑制效果与病毒作用时间、剂量呈正相关。Hochest33258荧光染色实验证实该毒株能引起核染色质断裂、边集、浓缩，产生典型凋亡特征。PI单染流式细胞术分析结果出现二倍体亚峰，细胞周期分析发现S期细胞呈现下降趋势，G0/Gl期细胞呈现上升趋势，细胞周期被阻滞在G0/G1期。Annexin-V/PI双染结果显示0MOI、0.2MOI、2MOI、20MOI病毒作用SMMC7721细胞48小时后，细胞凋亡率分别为2.1％、18.5％、23.8％、30.4％。为了阐明病毒诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导通路，我们采用Western Blot方法检测Caspase-3、p-JNK、p-AKT、p-P38、p-ERK蛋白的表达变化，发现该毒株感染细胞后能够下调p-AKT表达、激活JNK、Caspase-3，进一步检测Caspase-3的底物PARP蛋白，检测到85KD的剪切片断。说明Caspase途径是该新城疫病毒诱导肿瘤细胞凋亡的重要通路。 结论 L.筛选到一株能够有效抑制多种人肿瘤细胞株生长增殖的新城疫毒株，命名为NDV-FMW株。 2.该毒株能够显著抑制人肝癌细胞株SMMC7721、人肺癌细胞株A549的生长，20MOI病毒48小时抑制率达60％以上，且抑制效果呈时间．剂量依赖关系。 3.该毒株阻碍细胞周期进程，S期细胞比率降低，G0/G1期细胞比率升高，细胞周期被阻滞在G0/G1期。 4.该毒株激活JNK、Caspase-3、PARP，下调p-AKT表达，通过激活细胞凋亡通路诱导细胞凋亡。 5.该毒株具有潜在的临床应用价值，为进一步研究如构建重组高效溶瘤毒株奠定基础。

目录

论文说明：符号说明

声明

第一章溶瘤病毒研究综述

1新城疫病毒

1.1新城疫病毒的分子生物学特征

1.2新城疫病毒的溶瘤机制

1.3新城疫病毒溶瘤简史

1.4新城疫溶瘤毒株的研究进展

2其他溶瘤病毒

参考文献

第二章新城疫病毒FMW株对肿瘤细胞杀伤作用的体外实验

前言

材料与方法

1材料

2实验方法

结果

讨论

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文