3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系的建立及其初步应用

摘要

本研究分为四部分： 一、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶的初步鉴定 目的：对从鸡肝脏中提取的3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶进行初步鉴定。 方法：应用3-脱氧葡萄糖醛酮（3-Deoxyglucosone，3-DG）为底物的体外酶促反应体系，以辅酶NADPH的消耗反映提取得到的3-DG还原酶活性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定所提取酶蛋白的分子量；TLC法鉴定体外酶促反应的还原产物。 结果：体外酶促反应：反应组剩余NADPH的OD值（0.649±0.107，n=3）明显低于空白对照组（0.795±0.002，n=3）（p<0.05），表明提取的3-DG还原酶具有一定的活性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：显示两条蛋白质带，分子量分别为49kDa和180kDa，与文献比对，提示49kDa区带为3-DG还原酶；TLC法：酶促反应液中有两个斑点，与标准品比对，提示为3-DG（Rf值约0.6）和3-脱氧果糖（3-Deoxyfructose，3-DF）（Rf值约0.52）。 结论：可从鸡肝脏中提取得到含有活性的3-DG还原酶，其分子量约为49kDa，能催化其底物3-DG生成3-DF。可以选取鸡肝脏作为稳定获得3-DG还原酶的合适来源。 二、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系中底物3-脱氧葡萄糖醛酮含量测定方法的建立 目的：建立3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的含量检测方法，以底物3-DG的消耗来反映3-DG还原酶活性。 方法：应用2，3-二氨基萘柱前衍生，采用C18反相色谱柱（4.6*250mm，5μm）为固定相，5mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH7.4）-甲醇-乙腈（70：5：25）为流动相，检测波长为Ex/Em=271/503nm的高效液相色谱条件，测定3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的剩余量；利用2，4-二硝基苯肼作为显色剂，采用紫外分光光度法测定3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的剩余量。 结果：采用RP-HPLC法，3-DG峰呈尖峰，分离较好（理论塔板数为6459）：在1～5μg·mL-1浓度范围内成线性（Y=332.40x+34.50，r=0.9992）：精密度RSD：1.2％（n=5）；重现性RSD：6.3％（n=6）；24h内的稳定性考察，其RSD为3.5％。平均加样回收率为77.17％，RSD为8.98％（n=5）。采用UV法：3-DG在5～70μg·mL-1范围内成线性（y=0.0098x-0.0005，r=0.9988）；精密度RSD：0.7％（n=6）；重现性RSD：3.6％（n=6）；平均加样回收率：109.93％，RSD：16.73％（n=6）；稳定性的考察，其OD值在1h内下降约50％。RP-HPLC法和UV法测定酶促反应体系中底物3-DG的含量，两种方法相关系数r=0.86887，具有显著相关（p<0.001）。 结论：建立了HPLC和UV二种检测3-DG还原酶体外酶促反应体系中3-DG含量的方法，为以底物3-DG的消耗反映3-DG还原酶活性提供了基础。 三、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系最适条件、影响因素和评价范围考察 目的：对初步建立的3-DG还原酶体外酶促反应体系，进行各反应条件的优化，并考察相关因素对酶促反应体系的影响。 方法：用建立的RP-HPLC法检测酶促反应体系的3-DG含量，以单位时间内底物3-DG的消耗反映3-DG还原酶的活性，分别对反应体系中的辅酶NADPH浓度、3-DG还原酶酶量、底物3-DG浓度以及反应时间条件进行优化，并考察温度、pH、3-DG氧化酶、保存条件对3-DG还原酶活性的影响。 结果：辅酶NADPH浓度在0.15-0.25mg·mL-1之间，随着辅酶NADPH浓度的增加，3-DG的消耗量逐渐增加；当辅酶NADPH浓度达到0.25-0.30mg·mL-1之间，3-DG的消耗量较为平稳，接近平台。3-DG还原酶酶量在50-200μL时，3-DG消耗量与酶量的加入呈正比。当酶量超过200μL时，3-DG消耗量趋于平稳。底物3-DG浓度在50-400μg·mL-1下，3-DG的消耗量和3-DG的浓度成正比；3-DG的消耗率随之3-DG的浓度增加而降低。100μg·mL-1的3-DG浓度下，反应时间在60-120min内3-DG的消耗量较为稳定。3-DG的消耗量随着反应温度的升高而增加。3-DG的消耗量在pH7.4-7.9之间时最高，且较为稳定。3-DG还原酶体外酶促反应体系中，用NAD代替NADPH时，从鸡肝脏中提取的3-DG还原酶也能表达3-DG氧化酶活性，在提取纯化3-DG还原酶后即时测定3-DG还原酶活性，冻干酶粉的活性较液态条件下保存的酶活性较低。保存时间在30-180d内，随着保存时间的延长，3-DG消耗量降低。醛糖还原酶抑制剂（aldosereductaseinhibitor，ARI）依帕司他对3-DG还原酶有抑制作用，与反应组相比有显著性差异（p<0.001）；JZ01对3-DG还原酶活性有明显的增高作用（p<0.01）；槲皮素能部分抑制3-DG还原酶活性（p<0.05），7002而对3-DG还原酶活性无调节作用。 结论：以底物3-DG的消耗可以反映3-DG还原酶的活性。3-DG还原酶体外酶促反应体系最适宜条件为：100μL1mg·mL-13-DG溶液，100μL的2.5mg·mL-1NADPH，100μL的鸡肝初步纯化酶液混合，用50mmol·L-1PBS（pH7.4）缓冲溶液调反应体系至1mL，混合物于37℃培养90min。3-DG还原酶活性容易受到温度、pH变化的影响，反应体系温度在33-37℃范围内，pH在7.4-7.9时较为稳定。所提取的3-DG还原酶能表达3-DG氧化酶活性，对检测基本没有干扰。在-20℃条件下保存的3-DG还原酶酶液活性较高，随着保存时间的增加，3-DG还原酶活性降低。优化后的3-DG还原酶体外酶促反应体系，具有灵敏、稳定、可靠的特征，有望成为筛选药物的一种新方法。 四、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系（在防治糖尿病微血管并发症中）的初步应用 目的：应用建立的3-DG还原酶体外酶促反应体系对已知临床防治糖尿病并发症常用药物进行实验研究，并进行相关机理探讨。 方法：将不同浓度的葡萄糖溶液（5.5、12.5、25、50、100mmol·L-1）、ARI代表药依帕司他、羰基化合物清除剂代表药氨基胍、中药成分槲皮素分别加入到3-DG还原酶体外酶促反应体系中，37℃孵育90min。用RP-HPLC法或UV法测定3-DG还原酶体外酶促反应体系中的3-DG剩余量，以单位时间3-DG的消耗量来评价3-DG还原酶活性。 结果：与不加药液的反应组相比，50和100mmol·L-1葡萄糖溶液使3-DG还原酶活性下降，具有显著性差异（p<0.05），5.5、12.5、25mmol·L-1葡萄糖对3-DG还原酶活性无增高作用（p>0.05）；ARI依帕司他对3-DG还原酶活性有完全抑制作用，与不加药液的反应组相比有显著性差异（p<0.001）；氨基胍能增加3-DG还原酶体外酶促反应体系中的3-DG的消耗量，与不加药液的反应组相比有显著性差异（p<0.001）。中药成分槲皮素对3-DG还原酶活性有一定的抑制作用，与不加药液反应组相比有显著性差异（p<0.001）。 结论：高糖对3-DG还原酶活性无促进作用，在体外葡萄糖浓度达到50、100mmol·L-1时，可使3-DG还原酶活性下降。ARI依帕司他对3-DG还原酶活性完全抑制，提示依帕司他可能会引起机体3-DG代谢受阻，3-DG水平增高，而影响ARI防治糖尿病并发症的临床疗效。氨基胍能化学结合3-DG，对3-DG还原酶活性无调节作用；中药成分槲皮素对3-DG还原酶活性有一定的抑制作用。实验模型筛选出的（部分）药物与临床防治糖尿病并发症的经验一致，提示其除了本身已知的作用靶点外，还存在如对3-DG还原酶活性起调节作用的其他靶点。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶的初步鉴定

1.材料

1.1试剂

1.2仪器

2.方法

2.1实验溶液的配制

2.2 3-DG还原酶提取方法

2.3 3-DG还原酶活性测定

2.4 3-DG还原酶分子量测定

2.5 3-DG还原酶酶促反应的产物鉴定

3结果

3.1鸡肝脏中提取的3-DG还原酶活性测定

3.2鸡肝脏中提取的3-DG还原酶电泳鉴定

3.3 3-DG还原酶酶促反应产物鉴定

4讨论

第二部分 3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系中底物3-脱氧葡萄糖醛酮含量测定方法的建立

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1实验溶液配制

2.2.3-DG还原酶体外酶促反应体系

2.3 3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的RP-HPLC检测方法

2.4酶促反应体系中底物3-DG的UV检测方法

2.5统计学处理

3结果

3.1 3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的RP-HPLC检测方法

3.2 3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的UV检测方法

3.3 RP-HPIC法与UV法检测3-DG含量的相关性

4.讨论

第三部分 3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系最适条件、影响因素和评价范围考察

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1实验溶液配制

2.2 3-DG还原酶体外酶促反应体系的条件优化

2.3 3-DG还原酶活性的测定

2.4统计学处理

3结果

3.1 3-DG还原酶体外酶促反应体系最适条件

3.2 3-DG还原酶体外酶促反应体系影响因素考察

3.3 3-DG还原酶体外酶促反应体系评价范围

4讨论

第四部分 3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系(在防治糖尿病微血管并发症中)的初步应用

1.材料

1.1试剂

1.2仪器

2.方法

2.1溶液配制

2.2 3-DG还原酶体外酶促反应体系

2.3 3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的RP-HPLC检测方法(同“二”方法2.3)

2.4 3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的UV检测方法(同“二”方法2.4)

3结果

3.1高糖对3-DG还原酶活性的影响

3.2醛糖还原酶抑制剂对3-DG还原酶活性的影响

3.3羰基化合物清除剂对3-DG还原酶活性的影响

3.4槲皮素对3-DG还原酶活性的影响

4讨论

结 论

特 色

参考文献

附录 3-DG生物活性及其与临床疾病关系研究进展

附录 3-脱氧葡萄糖醛酮代谢酶研究进展

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢