兽疫链球菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因功能研究

摘要

兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus）是目前工业上发酵生产透明质酸(Hyaluronic acid，HA)的主要菌株。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase)主要催化UTP和葡萄糖-1-磷酸合成UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖作为葡萄糖基供体，参与多种寡糖和多糖的生物合成，是合成其他核苷二磷酸单糖的前体物质，在糖代谢过程和HA合成过程中起着重要作用。
　　本论文以S.zooepidemicus ATCC39920为研究对象，主要研究结果如下:
　　(1)通过序列BLAST发现S.zooepidemicus中存在两个UGPase基因，hasC1和hasC2。对两个基因转录情况研究表明两个基因在不同生长阶段均能正常转录。
　　(2)以温度敏感型自杀载体pSET4s为出发质粒构建敲除系统，成功获得基因缺失菌株△hasC1、△hasC2和△hasC1△hasC2。表型分析发现，△hasCl△hasC2在THB培养基上生长缓慢且无荚膜产生。在添加有半乳糖和甘露糖的培养基中，基因缺失菌株△hasC1△hasC2不能回复表型缺陷。
　　(3)二级结构预测结果表明，HasC1和HasC2二级结构基本一致，均由多个α-螺旋、β-折叠和线性结构组成。以Sphingomonas elodea ATCC31461 UGPase为模板同源建模预测三级结构，发现HasC1和HasC2同样包含三个核心结构域:碳端结构域、中心结构域（活性位点所在区域）和氮端结构域。Sphingomonas elodeaATCC31461 UGPase与HasC1和HasC2具有高度同源性，所预测的三级结构基本能真实反映S.zooepidemicus UGPase空间构象，为迸一步探究UGPase结构和功能提供理论依据。
　　(4)体外酶活分析结果表明，在37℃反应条件下，HasC1较HasC2具有更高的酶活力，分别为HasC11.1 U/mg，HasC20.78U/mg。蛋白的C-端较蛋白的N-端对酶活性具有更重要的作用。
　　(5)本研究通过建立HPLC分析检测方法，对发酵过程中产生的中间代谢产物UDP-Glc和UDPGlcUA进行了定量分析。研究表明，hasC1和hasC2基因的缺失导致UDP-Glc和UDP-GlcUA含量降低。此外，在发酵过程中分别对菌株的生长、乳酸产量、HA产量和蔗糖消耗等进行检测，结果显示hasC1和hasC2基因的缺失对菌体生长和HA合成有一定的影响，且hasC1缺失能较显著影响HA的合成，表明，S.zooepidemicus中hasC1和hasC2基因协同调控菌株的生长及HA途径中相关产物的合成代谢。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 兽疫链球菌

1．2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸

1．2．1 透明质酸合成途径

1．2．1 发酵条件

1．2．3 透明质酸合成与分泌机制

1．3 兽疫链球菌基因功能研究进展

1．4 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶研究进展

1．4．1 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶作用机制

1．4．2 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的生物学功能

1．4．3 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的同源性及拷贝数分析

1．4．4 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶三维结构分析

1．5 基因敲除技术

1．5．1 基因敲除技术原理

1．5．2 基因敲除策略

1．5．3 基因敲除技术的应用

1．6 大肠杆菌重组蛋白表达系统

1．7 本课题的研究思路

1．7．1 研究背景及意义

1．7．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 工具酶及相关试剂

2．1．3 主要仪器和设备

2．1．4 培养基和主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 兽疫链球菌基因组DNA的提取

2．2．2 琼脂糖凝胶电泳

2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．4 敲除载体pLH70的构建

2．2．5 敲除载体pLH75的构建

2．2．6 兽疫链球菌感受态的制备及电转化

2．2．7 敲除菌株的筛选及鉴定

2．2．8 兽疫链球菌总RNA的提取及RT-PCR

2．2．9 HasC1、HasC2蛋白表达载体的构建

2．2．10 HasC1、HasC2蛋白的诱导表达、纯化及酶活测定

2．2．11 兽疫链球菌代谢产物的分析测定

3 结果与讨论

3．1 S．zooepidemicus ATCC39920 UGPase基因的克隆与分离

3．2 UGPase基因转录水平分析

3．2．1 S ．zooepidemicus总RNA的提取

3．2．2 hasC1和hasC2基因的反转录及表达水平

3．3 S．zooepidemicus基因组DNA的提取

3．4 敲除载体pLH70、pLH75的构建

3．5．1 hasC1敲除载体pLH70的构建

3．5．2 hasC2敲除载体pLH75的构建

3．5 敲除菌株的构建及鉴定

3．5．1 hasC1敲除菌株的构建及鉴定

3．5．2 hasC2敲除菌株的筛选及鉴定

3．5．3 hasC1／hasC2双敲除菌株的构建及鉴定

3．6 S．zooepidemicus野生型与突变菌株的表型分析

3．6．1 S．zooepidemicus野生型与突变菌株的表型分析

3．6．2 S．zooepidemicus野生型与突变菌株在不同碳源条件下的生长情况

3．7 HasC1、HasC2结构预测及同源建模

3．8 HasC1、HasC2在E．coli BL21(DE3)中的表达、纯化及酶活分析

3．8．1 HasC1、HasC2表达载体的构建

3．8．2 HasC1、HasC2蛋白的表达及纯化

3．8．3 HasC1、HasC2蛋白酶活测定

3．9 兽疫链球菌代谢过程参数监测

3．9．1 生长曲线的测定

3．9．2 乳酸含量的测定

3．9．3 HA含量的测定

3．9．4 蔗糖含量的测定

3．9．5 胞内代谢产物的分析

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢