先天性心脏病标记物组关系模型的建立及其血清因子与易感基因关联的GO功能解析

摘要

背景：
　　随着精准医学的提出和发展，个体化医疗模式的逐步建立，基因测序技术快速发展，临床大数据及生物学网络不断建立，通过跨学科协同完成的技术应用在疾病预测、诊断与疾病病因分析方面，被不断完善，这些技术使实现对疾病和特定患者个体化精准治疗成为可能，也在提高疾病的预防中具有重要意义。
　　先天性心脏病是目前最为常见的先天畸形，同时也是引起婴幼儿死亡的首要原因。在新生儿中发病率约为0.7％~1%，严重危害婴幼儿的健康。在心脏的发育过程中涉及到多种因素在时间和空间上的相互作用，而胚胎期遗传因素和环境因素共同作用导致心脏的发育异常。由于先天性心脏病遗传机制的复杂性，对如何导致心脏畸形的原因仍不清楚。先天性心脏病的种类复杂多样，给先天性心脏病的治疗和预防造成了极大的难题。
　　临床研究表明血清学指标可以反映心功能状态，临床检测指标主要有高敏C反应蛋白、脂蛋白a、心肌肌钙蛋白、钠尿肽等，心脏的异常可导致血清学标记物的水平异常变化，通过先天性心脏病相关血清标记物组的优化建模可以为先天性心脏病的病因分析、早期诊断和治疗提供理论依据。
　　越来越多的研究表明先天性心脏病的发病机制和某些转录因子有关，而先天性心脏病的易感基因和血清学标记之间的关系目前尚未报道。而随着生物信息学的快速应用，GO（Gene Ontology）已成为生物信息领域中一个重要的工具和方法。GO数据库是一个结构化的标准生物学模型，涵括了基因的细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物学过程（biological process）。在基因功能注释方面，GO发挥着巨大的作用，GO可以分析基因或蛋白质在细胞中的位置、分子功能及其参与的生物学过程，从而将基因及其产物的注释简化为标准化的词汇。
　　本研究拟采用Meta分析方法从近年来的国内外研究中筛选出先天性心脏病的易感基因及血清危险因素；基于临床血清标记物水平，利用Logistic回归及支持向量机两种方法建立先天性心脏病的标记物组关系模型；通过GO分析对先天性心脏病易感基因及血清学标记物进行功能注释，建立易感基因及血清标记物之间的功能关系。
　　本研究运用临床医学、Meta分析及生物信息学GO分析等多学科结合的研究方法，为寻找与疾病病因相关基因表达和血清标志物的相关性提供了理论依据。利用血清标志物等指标建立的标记物组关系模型，也可能为其他疾病的早期预测提供技术支持。
　　该研究主要分为以下三个部分：
　　第一部分、先天性心脏病易感基因及临床研究血清危险因素的Meta分析
　　目的：
　　筛选先天性心脏病的易感基因及血清危险因素。
　　方法：
　　以CNKI、维普、万方、PubMed数据库作为文献的主要来源，易感基因的中文检索词为“先天性心脏病”、“基因”、“突变”，英文检索词为“congenital heart disease”，“gene”，“mutations”，发表年限为2006年1月1日至2014年06月31日；血清危险因素的中文检索词为“先天性心脏病”，“血清标志物”，“早期诊断”，英文检索词为“congenital heart disease”，“serum markers”，“diagnosis”，发表年限为2000-01-01至2014-10-31。纳入文献的全文均为中文或英文。提取有效的数据，利用Revman5.1软件进行Meta分析。
　　结果：
　　1.先天性心脏病易感基因纳入Meta分析文献19篇，其中NKX2.5基因相关文献7篇，GATA4基因相关文献11篇，FOG2基因相关文献4篇。NKX2.5基因合并OR值为2.02，95%CI为1.42-2.86；GATA4基因合并OR值为2.08，95%CI为1.50-2.88，FOG2基因合并OR值为19.43，95%CI为4.52-83.63。
　　2.先天性心脏病血清危险因素纳入Meta分析文献20篇，心肌肌钙蛋白合并SMD为0.33，95%CI为0.12-0.55；高敏C-反应蛋白合并效应量SMD为1.84，95%CI为1.36-2.32；BNP的合并效应量SMD为321.33，95%CI为279.03-364.29。
　　小结：
　　NKX2.5、GATA4、FOG2基因作为遗传因素，是先天性心脏病的易感基因；血清cTnI、hsCRP、BNP是先天性心脏病的危险因素。
　　第二部分、先天性心脏病临床标记物组关系模型的建立
　　目的：
　　建立先天性心脏病的标记物组关系模型并评价其应用价值。
　　方法：
　　1.选取以2009年12月至2014年09月我院心脏外科收治的80例（男性54例，女性76例，年龄7天~59岁）先天性心脏病患者及门诊体检正常者80例（男性38例，女性42例，年龄0.3~51岁）为研究对象。他们被分为两组：实验组（先天性心脏病患者）和对照组（正常体检者）。采用酶联免疫吸附分析
　　（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法检测血清BNP水平，采用免疫速率比浊法检测血清hs-CRP，采用免疫发光法检测血清cTnI水平，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗夹心法检测血清Lp(a)水平。以临床实验结果对Meta筛选出血清学结果进行对照补充。
　　2.以先天性心脏病诊断结果（患者=1，健康者=0）为应变量，用向前法作逐步Logistic回归分析筛选用于判断先天性心脏病的血清学标志物，通过逐步运算，最终得到建模指标。利用支持向量机建立先天性心脏病的血清标记物组关系模型，选取收集的80例先天性心脏病患者中的60例和80例健康对照者中的60例作为测试集样本，输入到支持向量机中进行训练。
　　3.以Logistic回归模型变量的检测水平为检验变量，以病理诊断结果为状态变量，制作其ROC曲线，根据ROC曲线下面积值（area under the curve，AUC）评价其对先天性心脏病的应用价值；选取其余的20例先天性心脏病患者和20例对照者作为测试集样本，输入训练后的支持向量机中网络，得到对应的判别结果（1或0），和目标对比后可得出判别准确率，并评价创建的标记物组关系模型的应用价值。
　　结果：
　　1.先天性心脏病患者的血清cTnI、hs-CRP、BNP、Lp(a)水平明显高于健康者，差异具有统计学意义。
　　2.Logistic回归分析结果表明，单变量Lp(a)、cTnI、BNP与先天性心脏病的发生相关，多变量cTnI、BNP、Lp(a)与先天性心脏病的发生非显著相关，Lp(a)与cTnI，Lp(a)与BNP，BNP与cTnI联合变量与先天性心脏病的发生相关，其联合检测ROC曲线下面积AUC分别为0.994、0.981、0.999，准确率分别为93.4%、87.1%、97.2%，具有较高的应用价值；支持向量机诊断模型的诊断准确率为85%。
　　小结：
　　先天性心脏病患者较正常人的血清cTnI、hs-CRP、BNP、Lp(a)水平存在显著异常；基于Logistic回归建立的Lp(a)与cTnI，Lp(a)与BNP，BNP与cTnI联合检测模型及基于SVM建立的先天性心脏病标记物组关系模型均具有较高的辅助诊断价值，Logistic回归建立的模型准确率更高，可为先天性心脏病的辅助诊断提供技术支持。
　　第三部分、血清标记物Lp(a)、BNP与先天性心脏病易感基因的生物信息学功能解析
　　目的：
　　探讨先天性心脏病易感基因及相关血清标记物之间的功能关系。
　　方法：
　　1.利用生物信息学方法，通过GO（Gene Ontology）分析对先天性心脏病易感基因及血清标记物分别进行功能注释，寻找血清标记物与易感基因之间的相同功能，并建立血清与基因之间的功能关系图。
　　2.利用实时荧光定量PCR检测先天性心脏病患者及健康对照者的易感基因表达水平，与血清标记物水平进行对比，分析易感基因及血清标记物之间的可能关系。
　　结果：
　　1.GO分析结果表明，先天性心脏病易感基因NKX2.5、GATA4、FOG2与血清标记物Lp(a)及BNP之间在功能上存在关联，而与血清cTnI、hs-CRP未发现相关性；
　　2.实时荧光定量PCR检测结果表明，相对于健康者，先天性心脏病患者的NKX2.5、GATA4、FOG2基因相对表达量2-ΔΔCt分别为0.59±0.18，0.47±0.14，0.33±0.99，病例组的表达量明显低于对照组，而病例组的血清Lp(a)及BNP水平显著高于对照组。
　　小结：
　　先天性心脏病易感基因NKX2.5、GATA4、FOG2与血清标记物Lp(a)与BNP之间在GO功能注释方面存在联系，与Lp(a)主要是脂蛋白跨膜转运及血液循环方面的关系，与BNP主要是基因表达及代谢过程方面的关系；NKX2.5、GATA4、FOG2的异常表达可能是导致Lp(a)与BNP水平异常的原因之一。

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英文摘要

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符号及缩略语

第一部分 先天性心脏病易感基因及临床研究血清危险因素的Meta分析

1 前言

2 研究对象与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

参考文献

第二部分 先天性心脏病临床标记物组关系模型的建立

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三部分 血清标记物Lp(a)、BNP与先天性心脏病易感基因的生物信息学功能解析

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

结论

综述:先天性心脏病及其相关基因的研究进展

个人简历

致谢