冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

摘要

金黄色葡萄球菌（S.aureus）是一种常见的食源性病原菌，易附着在食品加工设备、包装材料的上面形成生物膜，导致设备腐蚀和食品污染。冬凌草是我国的特色中草药，其活性成分主要是冬凌草甲素和乙素。现代研究证实，冬凌草的功效主要是抗肿瘤、抗菌消炎、抗氧化和增强免疫功能等。目前，冬凌草抑制食品致腐致病菌生物膜的研究还未见报道。因此，本文首先对冬凌草提取物的抑菌活性成分进行了GC-MS分析，其次对冬凌草提取物抑制金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜的形成进行了研究，最后初步探讨了冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌（S.aureus）的抑制机理和其胞外多糖合成的抑制作用，为食品工业和畜牧业中控制金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜的形成提供相关理论基础。
　　主要研究结果如下：
　　（1）采用超声乙醇回流提取、液液萃取法对冬凌草进行分离，将各个萃取物组进行抑菌试验，选出具有抑菌性的组分，并对其抑菌成分进行GC-MS鉴定。试验结果表明，抑菌成分主要存在于氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物中，且氯仿萃取物抑菌活性高于乙酸乙酯萃取物；氯仿萃取物中抑菌成分主要是冬凌草甲素，含量达到5.87％。通过高效液相色谱法对氯仿萃取物中的冬凌草甲素含量进行测定，氯仿萃取物中冬凌草甲素含量为91mg/g。
　　（2）通过刚果红平板及结晶紫染色法对S.aureus ATCC6538产膜能力进行了鉴定，试验结果表明，S.aureus ATCC6538具有产膜能力，且为中强产膜菌。采用银染法观察生物膜的形成情况，结果表明，培养1d后，生物膜开始形成；第3d，生物膜大量形成；第4d时，生物膜略微脱落；第4d过后，部分脱落；第6d和7d，生物膜脱落不明显。并采用稀释平板法进行活菌计数，对S.aureus生物膜形成过程进行分析，结果表明，0h到24h内，膜内细菌不断增殖；72h时，膜内细菌数达到最高峰；72h后，膜内活菌数开始减少。
　　（3）首先测定冬凌草提取物抑制S.aureus ATCC6538的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），其分别为125μg/mL和250μg/mL。然后采用银染法、MTT比色法研究了冬凌草提取物对 S.aureus ATCC6538生物被膜的抑制及清除作用，试验结果表明，冬凌草提取物对S.aureus ATCC6538生物膜有很好的抑制作用，且随着冬凌草提取物质量浓度的增大，抑制效果越明显，2MIC冬凌草提取物对 S.aureus ATCC6538生物膜形成的抑制率达到81%以上；冬凌草提取物对成膜24h的S.aureus ATCC6538生物膜的也具有一定的清除作用，当质量浓度高于2MIC时，清除率达到63%。采用扫描电镜（5000×）下观察不同质量浓度的冬凌草提取物对S.aureus ATCC6538生物膜形成的抑制效果，试验结果表明，冬凌草提取物对S.aureus ATCC6538生物膜有一定的抑制效果，且随着冬凌草提取物质量浓度的提高，抑制效果越强。
　　（4）在上述试验基础上，初步探讨了冬凌草提取物对S.aureus ATCC6538抑菌机理及其生物膜合成胞外多糖的抑制作用。试验结果显示，当冬凌草提取物质量浓度高于1MIC时，S.aureus ATCC6538生长受到抑制，细胞膜裂解，菌体内电解质流出，电导率增大；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，亚抑制浓度的冬凌草提取物能抑制菌体蛋白的表达和使其蛋白的表达量减少；采用荧光显微镜研究了冬凌草提取物对S.aureus ATCC6538生物膜胞外多糖的影响，结果表明，当冬凌草提取物质量浓度大于1MIC时，在生物膜形成的初始时间（0h）添加冬凌草提取物，胞外多糖的合成受到了显著的抑制；而成膜培养24h后加入冬凌草提取物，其对合成胞外多糖的抑制活性较弱。硫酸蒽酮法定量评价了冬凌草提取物对S.aureus生物膜胞外多糖合成的抑制效果，试验结果说明，初始（0h）加入冬凌草提取物能有效抑制S.aureus生物膜合成胞外多糖。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 生物膜概述

1.2 冬凌草概述

1.3 本课题的立题意义与目的

1.4 研究技术路线

第2章 冬凌草抑菌成分GC-MS鉴定

2.1 试验材料与仪器

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第3章 冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制及清除作用

3.1 试验材料与仪器

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌及其生物膜胞外多糖合成的抑制作用

4.1 试验材料与仪器

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果