香菇、灵芝不同菌株遗传多样性分析及灵芝原生质体融合研究

摘要

本论文应用RAPD、ISSR、SRAP三种标记技术分析了23个香菇菌株的遗传多样性。应用rDNA-ITS序列分析技术评价了16个灵芝菌株遗传多样性。应用SRAP标记技术对以赤芝05和赤芝06为亲本的原生质体融合子进行了鉴定，主要结果如下：
　　 1．以23个香菇菌株菌丝体DNA为材料，采用16个RAPD引物，5个ISSR引物及23个SRAP引物组合及PCR技术，分别扩增出138、77、144个DNA条带，其中多态性条带分别为81、56、81，多态性比率分别为58.8％、73.5％、56.3％，表明供试香菇菌株间存在一定的遗传差异，具有一定的遗传多样性。
　　 基于RAPD标记数据的类平均聚类分析（UPGMA）表明：23个香菇菌株两两间的相似系数范围是0.57～1之间。23（香九）与其他菌株的相似系数最小，最早于其他菌株分开；其它22个菌株在相似系数0.80以上分为二组，第1组共有17个菌株，包括为1（申香2号）、2（申香4号）、3（申香6号）、4（申香9号）、5（申香7号）、6（申香8号）、7（申香10号）、8（申香12号）、9（苏香）、10（武香1号）、11（L26)）、12（L03）、13（L66）、17（Cr02）、18（Cr04）、19（闽丰1号）、20（沪农1号），主要来自上海农科院食用菌研究所和福建三明真菌所，且多为中高温早熟型。第2组为14（241）、15（241-4）、16（庆科20）、21（浙香939-9）、22（浙香939-6），主要来自浙江庆元食用菌科研中心和丽水食用菌研究开发中心，多为中低温晚熟型。
　　 基于RAPD、ISSR、SRAP及三种标记综合分析所得到数据的UPGMA聚类结果基本一致，聚类图具有类似的结构，且与系谱关系相一致，表明三种标记技术均可用于香菇菌株遗传多样性分析。出自同一育种机构的菌株优先聚在一起，菌株间相似系数较高。上述表明23个香菇菌株的遗传多样性水平较低，彼此之间亲缘关系较近。
　　 2．以16个灵芝菌株菌丝体DNA为材料，采用ITS5/ITS4引物及PCR技术，扩增各菌株ITS序列。扩增序列遗传多样性分析表明，16个灵芝菌株转录间隔区（ITS1+ITS2）对位排列后总长度为490bp的序列中，共有139个变异位点，占28.3％，其中IST1和1TS2变异位点数目分别为66和73；保守位点数为351，占71.7％；59个信息位点，占12.0％；16个灵芝菌株在多处发生转换和颠换现象，共86个转换位点（G-A，C-T），13个颠换位点（C-G,T-A），ITS1区的转换/颠换比值高于ITS2区，而ITS2的变异位点多于ITS1变异位点.
　　 采用DNAman分析软件对16个灵芝菌株的ITS序列进行比对分析，发现供试菌株的遗传距离在0.000-0.121之间，树舌灵芝与灵芝F-1的遗传距离最小，为0.000，两者可能为同种异名菌株；黒芝02与惠州的遗传距离最大，为0.121；黒芝02与京大的遗传距离为0.117，与薄盖灵芝的遗传距离为0.120。
　　 采用MEGA（version 2.1）软件将16个灵芝菌株分成4个类群。第一类群共12个菌株，包括信州、惠州、京大、灵芝902、灵芝F-1、仙芝、美罗、圆芝、泰山灵芝、树舌灵芝、赤芝05、黄边灵芝；黑芝02、紫芝01两个聚为一个类群；薄盖灵芝和中芝分别独立聚为一个类群。
　　 上述结果显示，灵芝16个菌株各聚类组间存在一定得遗传差异，但组内菌株间遗传多样性水平较低，彼此之间亲缘关系较近。
　　 3．应用原生质体融合技术以赤芝05和06为亲本进行育种研究，经拮抗试验验证共得到30个融合子，并以赤芝05和赤芝06融合子及亲本DNA为材料，采用153个SRAP引物组合对融合子进行筛选鉴定，共筛选到4个清晰稳定、且含有两个亲本各自特异DNA条带的SRAP引物组合。将其用于融合子鉴定，结果表明：除共有条带外，2个只与亲本赤芝05有拮抗的融合子产生了赤芝06的特异条带；2个只与亲本赤芝06有拮抗的融合子产生了赤芝05的特异条带；在30个与双亲均有拮抗的融合子中，有7个融合子中同时出现双亲特异条带，即此7个融合子为双亲原生质体融合子。