驴新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鉴定和功能分析

摘要

在此项研究中，为鉴定新型Cathelicidin抗微生物肽，我们以家畜驴为研究对象，构建了驴肺脏cDNA文库；使用半巢式PCR的方法，从该cDNA文库中克隆得到两种新型Cathelicidin家族抗微生物肽：Ea-CATH1和Ea-CATH2。它们分别由25（KRRGSVTTRYQFLMIHLLRPKKLFA）和26（KGRGSETTRYQFVPVHFFPWNKLS DF）个氨基酸残基组成，与目前已鉴定的其它物种内源性Cathelicidin抗微生物肽相比，没有序列同源性。它们均是碱性多肽，分别含有7个和4个碱性氨基酸残基；两者的分子量均很小，分别为3060.75Da和3144.54 Da。
　　 在所筛选的32株细菌和真菌中，化学合成的EA-CATH1小肽对大部分菌株均有很强的杀菌活性，尤其是临床分离的耐药性菌株；Ea-CATH1对其中革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（MIC）大多在0.3-2.4μg/ml范围内。Ea-CATH1的抗菌活性在人血清中表现相当稳定，与血清在37℃孵育3天后，仍能发挥较强的抗菌能力；而且在高达20μg/ml的剂量下（远高于对应的MIC），Ea-CATH1对人血红细胞仅显示极微弱的溶血性（1.8％）。
　　 圆二色谱显示，Ea-CATH1在模拟生物膜结构的50％TFE/H2O溶液中主要呈现α-螺旋结构，但是在水溶液中主要采用无规则卷曲结构。在体外，0.6μg/ml的Ea-CATH1可以在2小时内彻底杀死10 6CFU/ml的金黄色葡萄球菌（ATCC2592），远胜于传统抗生素氨苄青霉素。利用扫描电子显微镜（SEM）观察经Ea-CATH1处理半小时的金黄色葡萄球菌（ATCC2592），结果证明Ea-CATH1能迅速破坏细菌的细胞壁和细胞膜，从而导致细胞裂解，细菌死亡；这或许是由杀菌动力学数据揭示的Ea-CATH1杀菌速度比传统抗生素快很多的原因。
　　 在CaCl2存在的条件下，Ea-CATH1表现明显的红细胞凝集活性，说明它可能抑制细菌分泌的多聚蛋白与宿主红细胞表面相互作用，从而限制细菌的繁殖和传播。在生理pH值附近的磷酸盐缓冲液（PBS）中，20μg/ml的Ea-CATH1表现较高的肥大细胞脱颗粒活性，说明它可能还是一种免疫效应分子，在宿主防御系统中介导重要的免疫反应。以上诸多特征和活性证明，Ea-CATH1很有希望成为一种先导化合物，并设计开发出新型抗微生物药物。