照射前后不同放射敏感性鼻咽癌细胞CNE1和CNE2中DNA-PK活性与核内表达的动态研究

摘要

[目的] 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一种发病极具地域特色的恶性肿瘤，由于辐射抗拒导致肿瘤局部未控或复发是放射治疗失败的主要原因之一。故研究鼻咽癌细胞辐射抗拒机制，寻找敏感的预测指标精确评估疾病及逆转放射抗拒是提高鼻咽癌5年生存率和改善生活质量的重要一环。本项目主要是以DNA-PK为切入点来探讨鼻咽癌的放射敏感性。 [研究方法] 1、电镜观察鼻咽癌细胞株CNE1(鼻咽高分化鳞癌细胞)和CNE2(鼻咽低分化鳞癌细胞)分化情况；生长曲线法求出两株细胞的倍增时间，比较增殖差异：集落形成实验测定CNE1和CNE2不同剂量下的存活分数，分别用线性二次模型和单击多靶模型拟合剂量存活曲线并求出放射生物学参数α、β、2Gy存活分数(SF2)和D<,0>、D<,q>、N以评价两株细胞的放射敏感性差异。 2、Signa TECT DNA-Dependent Protein Kinase Assay System试剂盒检测4Gy照射前后不同时间CNE1、CNE2中DNA-PK的活性变化差异。 3、激光共聚焦检测不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2细胞中4Gy照射前后Ku70、Ku80、DNA-PKcs在细胞中的定位改变，探讨照射能否引起DNA-PK在这两株细胞中的核转运。 4、Westem blot检测照射前后Ku70、Ku80在不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2细胞中的核内表达差异，用scion软件分析蛋白条带的光密度值作半定量分析。 [研究结果] 1、电镜下：CNE2细胞呈圆或椭圆形，细胞核浆比例大，细胞核大而不规则，可见多个大核仁；胞浆少量，细胞器较少，可见大量核糖体及糖蛋白，粗面内质网及线粒体少见，细胞呈低分化至未分化形态。CNE1细胞呈梭形，细胞膜间可见细胞间连接，但未见典型桥粒，细胞质内可见张力原纤维；细胞核浆比例较小，细胞核仁小，异染色质丰富，胞浆内可见大量核糖体、线粒体也较多，细胞相对于CNE2细胞相对分化较好。 2、CNE2增殖比CNE1快，CNE1细胞接种后经过一天的滞留期，从第2天开始到第6天为其指数生长期，之后缓慢进入平台期；CNE2细胞接种后经过短暂的滞留期后迅速进入指数生长期，至第5天细胞数达高峰，之后进入平台期。CNE1、CNE2的倍增时间分别为21.53h、18.08h，(p>0.05)。 3、CNE1存活曲线明显比CNE2平坦，CNE1各个剂量点的存活分数均比CNE2高，线性部分的α比CNE2小(0.323 VS 0.704)，D比CNE2大(0.1 VS 0.058)，SF2 CNE1大于CNE2(0.39 VS 0.11)，CNE1、CNE2的D<,0>分别为1.4413和0.4430，D<,q>分别为0.8285和0.6744。即CNE2细胞的内在放射敏感性显著高于CNE1细胞。 4、DNA-PK的活性检测结果：CNE1细胞中各个蛋白浓度的DNA-PK的活性均高于CNE2细胞：当蛋白浓度为25ug-200ugR寸，DNA-PK活性随着蛋白量的增多呈线性上升。取样25ug时，放射较为抗拒的CNE1细胞中DNA-PK活性较放射敏感的CNE2细胞明显高(4.137±0.688 VS 0.412±0.128，p<0.05)；4Gy照射后1h～24h，DNA-PK活性均有提高，且CNE1细胞中DNA-PK活性始终较CNE2细胞高。 5、激光共聚焦显微镜观察：鼻咽癌细胞株CNE1/CNE2细胞中，照射前DNA-PKcs、Ku70、Ku80细胞核和细胞浆均有表达，但主要定位于细胞核；4Gv照射可引起DNA-PK蛋白在CNE1/CNE2中发生明显的核内转运，照射后15min核内蛋白表达即有增强，至照射后1-6h核内表达最强，12h-24h开始减弱，但还是强表达在细胞核内。 6、Western blot结果显示：Ku70、Ku80在放射敏感性不同的鼻咽癌细胞CNE1/CNE2均有表达且表达很强，比较两株细胞总蛋白中Ku的基础表达无显著性差异：4Gy照射后蛋白表达水平也无明显变化。Ku70、Ku80蛋白在细胞浆蛋白中表达在两株细胞中比较无显著性差异，而在同一株细胞中，4Gy照射后较照射前明显减弱，上样15ug检测照射后1h后～24h细胞浆中只有微弱Ku蛋白表达： 在细胞核蛋白中，Ku蛋白表达水平4Gy照射后1h开始较照射前则明显增强，而在两株细胞中比较也无显著性差异。 [结论] 1、CNE1细胞分化较高，CNE2细胞呈极低分化形态；CNE2细胞的内在放射敏感性显著高于CNE1细胞。 2、CNE1细胞中DNA-PK的活性明显高于CNE2细胞；4Gy照射后两株细胞内的 DNA-PK活性均升高，CNE1细胞DNA-PK活性始终高于CNE2细胞；DNA-PK活性与其在这两株细胞总蛋白中的表达水平无明显线性相关。 3、DNA-PKcs、Ku70、Ku80主要定位于细胞核内，射线可以引起DNA-PKcs、 Ku70、Ku80在CNE1/CNE2中的核转运，导致照射后在DNA-PK核内表达比照射前明显增强。

目录

文摘

英文文摘

前言

实验流程图

第1章鼻咽癌细胞株CNE1/CNE2生物学特性的检测

引言

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第二章照射前后不同放射敏感性鼻咽癌细胞中DNA-PK活性的检测

引言

2.1材料与方法

2.2实验结果

2.3讨论

第3章放射导致不同敏感性鼻咽癌细胞DNA-PK核内转运的检测

引言

3.1材料与方法

3.2实验结果

3.3讨论

全文结论

参考文献

附录：Ⅰ缩略词

附录：Ⅱ在研期间科研工作情况

附录1：在研期间获奖情况

附录2：在研期间第一作者发表学术论文

附录3：在研期间发表文章

致 谢

原创性声明