诱导小鼠胚胎干细胞分化为小肠上皮样细胞及小肠内定植的研究

摘要

小肠上皮细胞是哺乳动物消化吸收的主要细胞，由于各种原因(放射损伤、化疗等)引起的小肠上皮细胞形态改变和功能受损，可导致严重的消化不良；小肠切除后引起的短肠综合征及Crohn's病等炎症性肠病所致的小肠顽固性溃疡严重的威胁着人类的健康，使患者的生存质量显著下降，是临床上面临的一个棘手的问题。以往的治疗方法包括胃肠外营养、应用生长激素和小肠移植等均有一定的疗效，但由于费用较高，病人的生活质量低下，小肠移植存在的供体缺乏、免疫排斥等问题限制了其应用。长期以来人们一直在探索能否有一个新的途径彻底解决这类疾病。 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)是从早期胚囊的内细胞团(iliner cell mass，ICM)分离出来的一种多能细胞系，是一群未分化的细胞，可以在体外长期不断增殖，自我更新，并保持多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型的细胞，甚至构建各种组织、器官。只要能找到一种使胚胎干细胞向着预想的方向进行定向分化的方法，我们就可以得到用于构建组织工程器官的种子细胞，甚至直接移植到体内对疾病实施治疗，这为我们提供了一个全新的手段。现在已经有实验研究证实胚胎干细胞可以在体外被定向诱导分化为神经细胞、心肌细胞、造血细胞、肝脏细胞、胰岛细胞、软骨细胞等多种细胞，但是体外诱导胚胎干细胞向小肠上皮细胞的定向分化国内外均未见报道。 本研究分三个部分，在第一部分中采用中性蛋白酶I和胶原酶Ⅺ消化19d胎鼠的小肠组织获得小肠上皮细胞，以作为本课题的阳性对照细胞；同时，通过胰酶的差异消化方法获得了13.5d胎鼠的小肠间质细胞，并对其进行了长期培养，获得培养上清液作为ESC的诱导液用于后续研究。第二部分着重对体外诱导小鼠：ESC向小肠上皮样细胞定向分化进行了观察研究。在特定的体外环境下ESC可以分化为多种细胞，而在整个分化过程中细胞所处的微环境起着决定性的作用，因此用小肠间质细胞的上清收集液模拟小肠上皮细胞发育的微环境，同时探讨人工诱导的分化条件，对不同浓度梯度和不同的时间加入表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的诱导效果进行了观察，并对分化后的细胞进行了检测。在实验的第三部分中，首先通过X射线照射制作了小肠损伤小鼠的模型，并用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)转染标记定向诱导分化后的ESC，并通过尾静脉注射入小鼠体内，观察其定植情况。研究目的： 本研究以多向分化潜能为基础，体外诱导ESC分化为小肠上皮样细胞，分析小肠间质细胞上清液和细胞因子EGF、HGF对诱导ESC向小肠上皮样细胞分化的作用，从而探索更优化的分化诱导体系，为构建组织工程器官提供种子细胞；观察诱导后的ESC在小鼠小肠内定植的情况，为其下一步体内移植治疗奠定实验基础。 结论 1．应用中性蛋白酶I和胶原酶Ⅺ消化的方法可获得比较纯化的上皮细胞，通过组织块培养法及胰酶差异消化可获得比较纯化的小肠间质细胞。 2．小肠间质细胞上清液对体外定向诱导ESC向小肠上皮样细胞分化有比较明确的促进作用。 3．表皮细胞生长因子(EGF)对体外定向诱导ESC分化为小肠上皮样细胞有一定的促进作用；肝细胞生长因子(HGF)对其无明显诱导优势。 4．分化早期加入EGF更有利于诱导ESC向小肠上皮样细胞的分化。 5． EGFP腺病毒载体可以转染诱导分化后的胚胎干细胞，转染率可达20％。 6．经诱导分化的ESC及随机分化的ESC均可以定植于放射损伤小鼠的小肠上皮组织而同组肝、肾组织未见其定植。

目录

文摘

英文文摘

前言

目的与技术路线

第一部分 小鼠小肠上皮细胞及间质细胞体外原代培养

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分诱导E14小鼠ESC分化为小肠上皮细胞的实验研究

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 ESC的小肠内定植研究

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

英文缩略词表

附图

致谢