选择性敲除小肠上皮细胞内Myd88分子的杂交小鼠的构建方法

摘要

本发明公开了一种选择性敲除小肠上皮细胞内Myd88分子的杂交小鼠的构建方法，包括以下步骤：1）自美国jackson公司购得CD11c-cre（小肠上皮细胞工具鼠）与条件性Myd88基因敲除小鼠；2）将上述两种小鼠进行杂交；3）构建引物，对杂交的小鼠后代进行基因型鉴定，筛选得到小肠上皮细胞内Myd88分子选择性敲除的杂交小鼠（myd88

说明书

技术领域

本发明涉及细胞构建领域，涉及一种选择性敲除小肠上皮细胞内Myd88分子的杂交小 鼠的构建方法。

背景技术

众所周知，树突状细胞（dendritic cell,DCs）一直以来被认为是人体内一种功能强大 且多样化的抗原递呈细胞，它能将体内外来源的抗原信息传递给多种免疫功能细胞，指挥 调动机体免疫反应进而达到生理性抵御或病理性的加重损伤的反应。而近来较多研究发现 小肠上皮细胞不仅作为肠道机械屏障的主要内容，同时其亦具有类似于抗原底层功能的免 疫活性。

正常人小肠粘膜的表面积达250平方米，同时肠腔内存在100万亿个细菌。我们的前 期研究发现肠粘膜下的免疫细胞可能在肠道细菌抗原的刺激下改变局部及全身的免疫状

态，然而新近的研究则提示肠上皮不仅构筑了机械屏障，同时亦具有主动抑菌以及一定的 免疫活性。其与肠内大量致病菌的广泛的频繁的相互作用必定对维持正常的肠道菌群以及 防御致病菌的侵犯具有具足轻重的地位。

首先，在正常状态下，肠上皮可通过以下抑制细胞免疫反应的途径维持小肠对肠内致 病菌的耐受状态：①表达MHC II分子，诱导调节性T的优势分化[9]；②大量常驻菌分泌 的LPS刺激肠上皮合成并分泌TGF-β，进而促使肠粘膜下的树突状细胞诱导Th2型的淋 巴细胞分化。

然而当各种原因导致的肠内菌群紊乱以及大量致病菌滋生的情况下，肠上皮亦可通过 以下方式直接或间接地防御致病菌的侵犯：①合成并分泌以IL-8等细胞因子，促使以中性 粒细胞聚集为特征的非特异性炎症反应[12,13]；②诱导DCs活化，促进T、B淋巴细胞的 分化，增强细胞及体液免疫的能力。Yi Yang等发现肠上皮通过TLR2接受抗原刺激后通过 Myd88分子介导的通路以分泌视黄醇（Retinoic acid,RA）的方式刺激DCs诱导Th1型的 淋巴细胞分化；③常驻菌分泌的LPS刺激肠上皮并由Myd88通路介导合成并分泌能够高 效杀灭革兰氏阳性菌的RegⅢγ[15]。Katharina Brandl[16]等发现广谱抗生素的使用正是通 过抑制RegⅢγ的合成进而导致大量VRE的生长。

但是肠上皮究竟是在何种状态下由介导耐受向防御的转变，以及参与这种转变的确切 分子生物学机制目前尚不明确。我们的前期研究发现致肠炎的G+球菌能够造成肠上皮 （caco2细胞）明显的损伤，在对受损的caco2细胞进行基因芯片分析（microarray）发现 其决定胞浆内MAPK家族分子以及NF-KB分子的基因的均出现了明显的异常表达，而其 上游的信号通路分子均为Myd88。因Myd88分子可能参与多种细胞因子、RA以及RegⅢ γ的合成，我们推断在致肠炎的VRE与小肠上皮的相互作用的分子生物学机制中，与 Myd88分子相关的TLR受体及信号通路可能起着重要的作用，故如能培育出的肠上皮 Myd88基因条件性敲出的小鼠，将对该领域的深入的研究起到重要作用。

发明内容

本发明的目的正是要克服上述技术的不足，而提供一种选择性敲除小肠上皮细胞内 Myd88分子的杂交小鼠的构建方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：。这种选择性敲除小肠上皮细胞内Myd88分 子的杂交小鼠的构建方法，包括步骤如下：

（1）、选择CD11c-cre与条件性Myd88基因敲除小鼠；构建引物，分别对两种小鼠通 过PCR技术进行基因型鉴定；

（2）、将上述两种小鼠进行杂交；

（3）、对杂交的小鼠后代进行基因型鉴定，筛选得到小肠上皮胞内Myd88分子选择性 敲除的杂交小鼠myd88^Flox/Flox;Neurog3-cre。

对上述两种基因型的小鼠的杂交后代进行基因型鉴定，以引物1和引物2，引物4、 引物5、引物6和引物7同时阳性的小鼠即为myd88^Flox/Flox;Neurog3-cre小鼠；其中引物1 的DNA序列为GTT GTG TGT GTC CGA CCG T，引物2的DNA序列为GTC AGA AAC AAC CAC CAC CAT GC，引物4的DNA序列为GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC，引物5的DNA 序列为GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT，引物6的DNA序列为CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT，引物7的DNA序列为GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。

本发明有益的效果是:本发明构建的小肠上皮细胞内Myd88分子选择性敲除的杂交小 鼠的生物学特征为小肠上皮细胞不表达Myd88分子，其可较好地应用于小肠上皮免疫效应 及分子机制的活体研究。

附图说明

图1是本发明鉴定野生型和myd88^Flox/Flox小鼠示意图；

图2是本发明鉴定野生型和Neurog3-cre转基因小鼠示意图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合举例，对本发明进行 进一步详细说明。应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。

这种选择性敲除小肠上皮细胞内Myd88分子的杂交小鼠的构建方法，包括步骤如下： 1）自美国jackson公司购得CD11c-cre（B6.FVB(Cg)-Tg(Neurog3-cre)C1Able/J）与条件性 Myd88(B6.129P2-Myd88tm1Defr/J)基因敲除小鼠；根据公司提供的信息构建引物，分别对两 种小鼠进行基因型鉴定（PCR技术）。

2）将上述两种小鼠进行杂交；

3）对杂交的小鼠后代进行基因型鉴定，筛选得到小肠上皮胞内Myd88分子选择性敲除的 杂交小鼠（myd88^Flox/Flox;Neurog3-cre）。

(一)小鼠基因组DNA的制备

1、剪15天内小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。

2、每管加入裂解缓冲液500ul DNAiso(takara DNAiso Lot:B101-1)。

3、放置在常温250rpm震荡过夜。

4、待组织溶解完全，向每管加入2倍体积乙醇，摇匀后室温放置，5min。

5、待絮状沉淀产生，迅速颠倒几次离心管，5000rpm，5min，去上清。

6、用70%乙醇洗涤沉淀两次，洗完后置空气中干燥。

7、加灭菌水，琼脂糖胶电泳鉴定，定量。

8、室温至DNA完全溶解后(24-48hr)可用于PCR分析。

(二)PCR鉴定小鼠的基因型

引物1（GTT GTG TGT GTC CGA CCG T）和引物2（GTC AGA AAC AAC CAC CAC CAT GC）能 够鉴定野生型和myd88^Flox/Flox小鼠，这对引物能从条件性基因敲除小鼠中扩增出大小为 353bp和/或266bp的条带用于鉴定野生型和转基因阳性小鼠。结果见图一。

用引物4（GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC）、引物5（GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT）、 引物6（CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT）和7（GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C） 来鉴定Neurog3-cre的野生型和转基因小鼠，这对引物能从转基因小鼠中扩增出大小为 100bp和/或324bp的条带，但不能区分杂合子和纯合子。结果见图二。

（三）小鼠杂交和基因型筛选myd88Flox/Flox;Neurog3-cre小鼠

对上述两种基因型的小鼠的杂交后代进行基因型鉴定，以引物1（GTT GTG TGT GTC CGA CCG  T）和引物2（GTC AGA AAC AAC CAC CAC CAT GC）和引物4（GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA  TC）、引物5（GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT）、引物6（CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA  TCT）和7（GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C）同时阳性的小鼠即为myd88^Flox/Flox;Neurog3-cre小鼠。

所获得的myd88^Flox/Flox;Neurog3-cre小鼠:

1)全部通过基因型鉴定；Neurog3-cre:Myd88^f/f为纯合子的基因型，子代均可用于实验， 目前正处于扩群阶段。

2)该种小鼠的生育、生产、发育及生殖等基本生命现象正常，可用于体内对照试验。

3)该种小鼠的免疫功能正常，可用于免疫相关的实验动物机制研究。

序列表

<110>梁廷波

<120>选择性敲除小肠上皮细胞内Myd88分子的杂交小鼠的构建方法

<130>

<160>6

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>1

GTT GTG TGT GTC CGA CCG T                        19

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>2

GTC AGA AAC AAC CAC CAC CAT GC                   23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>2

GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC                   23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>2

GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT                   23

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>2

CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT                  24

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>2

GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C                25