鼻咽癌中肿瘤干细胞—表面标志物及分离鉴定的探索

摘要

关于鼻咽部干细胞的研究已有一些报告，Zhang等利用Brdu标记LRCs证实鼻咽黏膜基底部有散在干细胞也发现散在LRCs。BrdU标记的鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)细胞株5-8F接种到裸鼠皮下，8周后也可发现散在LRCs：Wang等利用Hoechst33342在NPC细胞株CNE2中分离出类似干细胞的侧群细胞，且认为CK19是NPC干细胞标志物。 CD133作为上皮和间叶正常及肿瘤干细胞的重要标志物，但其是否为NPC肿瘤干细胞的标志物尚不清楚。所以本研究首先采用免疫组化等技术检测NPC组织和细胞株中包括CK19在内的角蛋白系列和CD133以寻找鼻咽干细胞标志物；利用Brdu体外标记鼻咽癌干细胞5-8F，经体外培养和裸鼠体内接种，获得LRCs细胞，比较LRCs和CD133的表达，从另一角度证明CD133可能是鼻咽癌干细胞标志物。在此基础上，利用免疫磁珠分选系统从鼻咽癌细胞株5-8F细胞中分选CD133+细胞，接着通过球囊形成、平板克隆、光学显微镜、电镜观察等实验对所获得的CD133+干细胞细胞特性进行检测；最后通过TPA和Brdu药物作用，试图寻找富集干细胞方法。 方法： 1.寻找鼻咽癌干细胞表面标志物 CK19等角蛋白和CD133在NPC组织和细胞株中检测 免疫组化检测58例NPCs、28例鼻咽粘膜慢性炎、NPC细胞株裸鼠移植瘤和鼻咽癌细胞株中CK19、CK18、CK8、CK14和CK5/6等角蛋白表达；39例带有不典型增生和正常粘膜上皮的鼻咽癌组织以及各类细胞株中检测CD133表达。根据免疫组化结果判断CK19等角蛋白和CD133作为鼻咽癌干细胞的可能性。 2.CD133+细胞分离与纯度分析 1)免疫磁珠法分选CD133+细胞 2)分选后细胞纯度分析： a.流式细胞仪分析分选后的CD133+细胞的纯度； b.免疫细胞化学检测分选后的CD133+细胞的纯度； c.实时荧光定量PCR检测分选后的CD133+细胞和CD133-细胞中CD133mRNA水平。 3.鼻咽癌细胞株5-8F中LRCs细胞检测，并与CD133+细胞率进行比较 a.5-8F细胞株体外LRCs实验 细胞生长至指数期时，向培养基中加入Brdu(10ng/ml)，连续培养7天后，撤除Brdu，继续培养14天。培养过程中，分别在第2天、第7天和第14天，在洁净的盖玻片上做细胞爬片，然后进行免疫细胞化学及免疫荧光染色。光镜下选取十个高倍视野进行计数。 b.裸鼠体内成瘤 5-8F细胞处于对数生长期时，向培养基中加入Brdu(10ng/ml)，48小时后，以1×106个细胞分别注入2只裸鼠双侧腋下，观察成瘤情况。8周后，取出瘤块，固定、石蜡包埋并切片，免疫组化检测Brdu，Brdu阳性细胞即为标记滞留细胞(LRCs)。光镜下选取十个高倍视野进行计数。 c.比较CD133和Brdu表达情况，从另一角度验证CD133可能为鼻咽癌干细胞标志物。 4.CD133+细胞生物学特性鉴定 1)Sphere形成实验 培养基配方：无血清培养基DMEMF12+EGF+B27；CD133+细胞、CD133-细胞和未分选5-8F细胞以1000/ml的密度进行培养，适时观察Sphere形成时间、数量和大小。 2)克隆形成实验 把三种细胞(即CD133+细胞、CD133-细胞和未分选5-8F细胞)分别200个于12孔培养板中培养，一种细胞3个复孔，当见肉眼可见的克隆形成，终止培养，显微镜下计数大于50个细胞的克隆，并进行统计学分析 3)光学显微镜、扫描及透射电镜观察 4)TPA和Brdu对5-8F细胞中CD133、ABCG2mRNA水平、蛋白水平以及CD133+细胞数量和生物学行为的影响 结论及创新之处： 1.本实验证实了鼻咽癌中CSCs的存在；通过免疫组化等方法，并和LRCs做比较，初步证明CD133+癌细胞可能是鼻咽癌干细胞；并对前人提出的CK19作为鼻咽癌干细胞标志物提出疑问。 2.免疫磁珠分选法是分离CD133+细胞的一个行之有效的方法。 3.Sphere实验和体外克隆实验显示CD133+细胞和CD133-细胞生物学行为不同；在光学显微镜和电镜下观察，CD133+和CD133-细胞形态上有差别。 4.Brdu除作为标记物的功能外，在mRNA水平促进细胞中CD133、ABCG2的表达，同TPA作用相反，后者抑制CD133和ABCG2的表达。在细胞水平上，它促使CD133+细胞数量增多，侵袭行为增强，同TPA有协同作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写注解

声明

前言

技术路线

第二章鼻咽癌干细胞表面标志物探讨

第二章鼻咽癌细胞株中CDl33+细胞的分离

第三章鼻咽癌细胞株中LRCs的标记与检测

第四章CDl33+细胞特性鉴定及TPA和Brdu对CD133表达的影响

全文小结

攻读学位期间成果

致谢