MTA1基因在非小细胞肺癌转移预后中的意义及机制初步研究

摘要

研究背景和目的: 肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，被认为是全球的头号癌症杀手，在恶性肿瘤中肺癌的发病率及死亡率均居首位。随着大气污染的加重，肺癌发生率呈明显上升态势。而在所有肺癌当中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）大约占80%。尽管近来在诊断和治疗取得了进展，肺癌的预后仍然很差，其5年生存率<15%，而肿瘤发生转移是导致肺癌患者死亡的主要原因。因此，探索研究新的基因功能与肺癌转移的恶性特征的关系，对于提升肺癌进展相关分子机制的了解、设计合理的治疗药物及改善肺癌的临床预后有潜在的重要性。 转移是一个复杂的疾病，涉及了一系列事件包括以一种协调的方式刺激或抑制各种基因产物，导致肿瘤细胞侵袭并从原发肿瘤脱落，进入血液和淋巴，在远处部位通过黏附停留，穿透血管壁，诱导血管生成，逃避宿主抗肿瘤反应，在转移部位生长。 近来，转录辅调节因子MTA（Metastasis-associated proteins，转移相关蛋白）家族的作用已引起人们的广泛关注。MTA是核小体重塑及组蛋白去乙酰化（nucleosome remodeling and histone deacetylation，NuRD）复合物不可缺的部分。MTA家族成员存在于不同的NuRD复合物中，在MTA家族成员间缺乏功能冗余性。MTA家族蛋白通过修饰关键靶基因的乙酰化状态调节不同的细胞通路，包括激素作用、上皮细胞向间充质细胞转化、分化、蛋白稳定性和发育以及细胞命运程序。 MTA1是MTA基因家族的基础成员，最初是在鼠转移性乳腺癌中经cDNA库差异筛选技术发现的，后来的研究发现MTA1在人类肿瘤中有普遍的上调，与多种肿瘤的发生及转移特征密切相关，包括子宫内膜癌、胃肠类癌瘤、结肠癌和肝细胞肝癌、食道鳞状细胞癌、前列腺癌、胸腺瘤等。在乳腺癌、肝癌中，MTA1表达还与复发生存等预后相关。体外研究显示通过RNA干扰下调MTA1可有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231生长并导致细胞周期的阻滞，且在很大程度上逆转了食管癌EC9706细胞株、B16F10黑色素瘤细胞迁移、侵袭等恶性表型。 本研究拟通过免疫组化的方法，观察MTA1在非小细胞肺癌中的表达，结合临床随访资料进行统计分析，确定MTA1表达与临床病理特征的关系，评价其在非小细胞肺癌患者生存方面的预后价值；利用RNA干扰技术抑制肺癌95-D细胞株MTA1的表达，观察处理后对肺癌细胞体外增殖、侵袭能力的影响；利用人体组织标本，通过免疫组化方法检测MTA1表达水平与HIF-1α表达的相关性，初步探讨MTA1在肺癌转移中的机制。我们的研究将为揭示MTA1基因在肺癌侵袭转移中的作用提供新的实验依据，并为肺癌的转移治疗和药物筛选提供理想的靶点。 方法: 1、非小细胞肺癌组织中MTA1的表达及意义 应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法检测MTA1蛋白在100例非小细胞肺癌组织中的表达情况，结合临床病理资料进行回顾性分析；应用SPSS13．0软件进行统计学处理，用X2检验分析MTA1蛋白免疫强度与临床病理特征的相关性。用Kaplan-Meier计算生存曲线，用log-rank检验分析生存曲线。应用Cox比例风险回归模型通过单变量和多变量分析来决定各种因素的预后意义。 2、MTA1基因沉默对肺癌细胞生物学特性的影响 利用在线数据库和软件设计MTA1基因干扰片段，构建特异性MTA1的慢病毒干扰载体。利用MTA1慢病毒干扰载体转染95-D肺癌细胞，建立MTA1基因沉默的肺癌细胞株，荧光定量PCR和Western blotting检测MTA1基因干扰效率。利用MTT法及流式细胞术检测MTA1基因沉默后对细胞体外增殖的影响；利用体外侵袭小室进行体外侵袭实验，检测MTA1基因沉默后对肺癌侵袭能力的影响。采用SPSS13．0统计软件进行处理，体外增殖实验采用析因方差分析，细胞周期及侵袭实验采用两样本t检验。 3、MTA1、HDAC1和HIF-1α在非小细胞肺癌的表达及相关性 应用免疫组化SuperPicTures二步法检测59例非小细胞肺癌组织中MTA1、HDAC1和HIF-1α蛋白的表达情况，应用SPSS13．0统计软件进行统计学分析。用X2检验分析蛋白（MTA1、HDAC1、HIF-1α）免疫染色强度之间的相关性以及HIF-1α蛋白阳性表达与临床病理特征的相关性。 结果: 1、非小细胞肺癌组织中MTA1的表达及意义 在100例非小细胞肺癌组织中，67例（67．0%）呈现细胞核MTA1蛋白高表达。MTA1蛋白高表达与肿瘤临床分期相关，晚期肺癌患者（Ⅲ和Ⅳ期）MTA1的表达水平高于早期的肺癌患者（Ⅰ和Ⅱ期）（P=0．002）。MTA1高表达与淋巴结转移相关（P=0．013），有淋巴结转移的肺癌MTA1高表达率更高。MTA1高表达与患者的年龄、性别、肿瘤组织病理学分型、分化程度、局部侵袭程度及远处转移不相关（P值分别为：0．572、0．728、0．319、0．196、0．269、0．143）。应用Kaplan-Meier计算生存曲线，发现MTA1蛋白高表达肺癌患者中位生存时间为27．9（1．4～57．6）个月，低于MTA1蛋白低表达患者中位生存时间56．8（4．9～59．3）个月，二者的差异经Log-rank检验具有显著性（X2=8．630，P=0．003）。将MTA1蛋白表达和临床病理特征逐个与肺癌患者的生存时间进行单因素分析，结果显示MTA1蛋白表达、局部侵袭程度、淋巴结转移、远处转移、临床分期是影响肺癌患者生存时间的重要因素（P值分别为：0．004、0．001、0．001、0．001、0．000）。多因素分析，肺癌的局部侵袭程度（T分期）、临床分期是独立的预后因素（P值分别为0．015、0．000），而MTA1不是独立的预后因素（P=0．108）。 2、MTA1基因表达沉默对肺癌细胞生物学特性的影响 构建了干扰MTA1基因表达的慢病毒干扰载体。用慢病毒感染肺癌细胞株95-D，获得稳定转染细胞，命名为95-D/MTA1-细胞，荧光定量PCR和Western blotting结果显示利用RNA干扰沉默MTA1基因后，95-D/MTA1-细胞中MTA1mRNA被下调了91%，MTA1蛋白被下调了>60%。 MTT法观察MTA1基因表达沉默后体外细胞的增殖情况，与95-D细胞相比，95-D/MTA1-细胞的增殖速度减慢，并且呈时间依赖关系（F=252．040，P=0．000）。利用流式细胞术检测两组细胞的细胞周期，结果显示95-D/MTA1-细胞周期中G2/M期的比例减少（t=17．633，P<0．001），S期比例减少（t=3．722，P=0．020），细胞增殖指数降低（t=23．934，P<0．001）。表明Tiam1基因表达沉默后细胞增殖缓慢。结果提示Tiam1基因表达水平减低后，肿瘤细胞体外生长被显著抑制。 体外侵袭小室实验检测MTA1基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变，结果显示，肿瘤细胞侵袭24h后，95-D和95-D/MTA1-细胞均穿透基底膜向下侵袭，在聚碳酸酯膜上可见肿瘤细胞变形的形态，95-D和95-D/MTA1-细胞侵袭能力不同，95-D细胞侵袭数为850．00±45．83，95-D/MTA1-细胞侵袭数为35．00±6．25，差异具有显著性（t=30．522，P<0．001），结果说明MTA1基因表达沉默后降低了肺癌细胞的侵袭能力。 3、MTA1、HDAC1和HIF-1α在非小细胞肺癌的表达及相关性 59例标本中有32例（54．24%）呈现MTA1染色阳性，且细胞核及胞浆均有表达，呈棕黄色颗粒状，其中弱阳性（得分=1）、中度阳性（得分=2）、强阳性（得分=3）分别为17例、14例、1例；59例标本中仅2例（3．39%）呈现HDAC1染色阴性，且HDAC1阳性表达均定位于细胞核；59例标本中有30例（50．85%）呈现HIF-1α染色阳性，在HIF-1α染色阳性的标本中，可见HIF-1α主要表达在细胞胞浆，呈棕黄色颗粒状，部分细胞胞核也有阳性表达。 结论: 1、在肺癌组织中，MTA1表达与肺癌的转移、临床进展相关，是影响肺癌预后的重要因素之一，可作为评估肺癌恶性潜质的分子指标，对判断肺癌预后有重要意义； 2、MTA1基因涉及了肺癌细胞转移的多个步骤，包括肿瘤生长和侵袭，针对MTA1沉默的特异性RNAi可能是一种有效的肺癌生物治疗的新途径。 3、HIF-1α在肺癌转移及放化疗抵抗中可能起重要作用；MTA1对乏氧通路的正向调节可能是与肺癌经血管侵袭发生远处转移相关的中间机制。 本研究的创新之处 1、发现MTA1与肺癌的增殖、侵袭及预后相关，为开展肺癌基因靶向治疗奠定了理论基础； 2、建立了MTA1基因沉默的肺癌细胞株，为研究MTA1基因在肺癌发生发展中的作用提供了有价值的研究工具。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章非小细胞肺癌组织中MTA1的表达及意义

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章MTA1基因沉默对肺癌细胞生物学特性的影响

1材料与方法

2 结果

3讨论

第三章转移相关蛋白1(MTA1)、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和乏氧诱导因子1α(HIF-1α)在非小细胞肺癌的表达：相关性及可能的调节机制

1材料与方法

2结果

3讨论

全文小结

参考文献

攻读博士学位期间研究成果

致谢

统计学审稿证明