双氢青蒿素/聚乙二醇单甲醇-聚左旋乳酸嵌段共聚物胶束的制备及体内外性质研究

摘要

研究背景:
　　 青蒿素(Artemisinin，ART)是一种从菊科植物黄花蒿中分离出来的新型抗疟药，其分子结构中含有过氧桥的倍半萜内酯结构;双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的一个重要衍生物，是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物，可由青蒿素经四氢硼钠还原而成。最近研究发现，DHA除了良好的抗疟活性外，还具有良好的抗肿瘤作用。体内外实验证明，双氢青蒿素对多种人类和动物肿瘤细胞均具有毒性作用，其主要机制是通过铁离子介导的细胞损伤;同时，对多种荷瘤动物模型都有一定的治疗作用。由于双氢青蒿素是油水均难溶性物质，且分子结构中具有特殊的过氧基团，易受光、热、氧气等因素影响而分解;临床上应用的剂型有片剂、栓剂、混悬剂，但DHA在胃肠道溶出与分解缓慢造成口服给药生物利用度低，使其不能充分发挥药效。因此，开发双氢青蒿素注射剂新剂型对其在抗肿瘤中的应用具有一定的意义。
　　 两亲性嵌段共聚物聚乙二醇单甲醚-聚左旋乳酸( mPEG-PLLA)，能在生物体内被水解或酶解后吸收并排出体外。近年来，因其良好的生物相容性与应用安全性广泛用作疏水性药物载体;同时，能在水中自组装形成纳米级核-壳结构的聚合物胶束，药物进入内核的疏水区域，一方面提高难溶性药物的溶解度，增加胶束体系的稳定性;另一方面可避免体内网状内皮系统(RES)的吞噬或肝脾等组织吸收，提高药物在血液中的循环时间、延长生物半衰期等。因此，mPEG-PLLA嵌段共聚物在药物递送过程中具有明显的优势，在传递不溶性抗癌药物方面将显示出良好的应用前景。
　　 冷冻干燥是利用升华的原理进行干燥的一种技术，是将被干燥的物质在低温下快速冻结，然后在适当的真空环境下，使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出的过程。通过冷冻干燥技术，将遇热不稳定的载药纳米胶束体系制成冻干产品，以提高纳米胶束体系的长期稳定性，利于制剂的保存、运输与使用。
　　 研究目的:
　　 通过应用生物相容性及降解性好的材料mPEG-PLLA包载疏水性药物DHA，并制成冻干粉针剂，达到增加DHA的体外溶出度，延长DHA释放时间，进而提高DHA的生物利用度;制备的胶束粒径小，性质稳定，形态良好。并考察DHA/mPEG-PLLA在体外对特定的细胞的抗肿瘤活性，在体内对荷特定肿瘤裸鼠的治疗作用。为DHA用于抗肿瘤研究提供理论基础，同时也为DHA用于临床提供剂型参考。
　　 研究方法与结果:
　　 本课题主要是研究载DHA的mPEG5000-PLLA3200嵌段聚合物胶束(以下简称DHA胶束)的制备工艺及体内外性质，主要有五个方面的内容，具体包括:DHA胶束制备工艺优化，DHA胶束的表征，DHA胶束的体外性质探索，DHA胶束体外抗肿瘤细胞作用，DHA胶束体内抗肿瘤作用等。
　　 第一部分:DHA胶束制备工艺优化
　　 采用高效液相色谱法(HPLC)测定制剂中DHA的含量，色谱柱:ECOSILC18(4.6×150mm，5μm);流动相为乙腈:水=60∶40;流速为1ml/min;检测波长为210nm;进样量为20μl;控制柱温为(25±2)℃。采用单因素考察实验分别考察制备方法、所用有机溶剂、药物与共聚物的质量比和有机相与水相的体积比对DHA胶束的粒径与包封率的影响。采用正交设计实验，应用溶剂挥发法，以有机溶剂、DHA与mPEG5000-PLLA3200的质量比和有机相与水相的比作为影响因素，以粒径、载药量和包封率为评价指标，采用正交表L9(34)进行实验设计优化处方。所得的DHA胶束溶液在加入一定的冻干保护剂后，冷冻干燥得到冻干产品。
　　 结果显示:以峰面积对浓度作图，并进行线性回归，相关系数为r=0.9999(n=6)，且重现性良好，即DHA在10-400μg/ml的浓度范围内线性关系良好。DHA胶束的平均回收率为105.32％，RSD为3.20％(n=3)，上述方法可以很好的测定制剂中DHA的含量。DHA胶束粒径及包封率受制备方法、所用溶剂、药物与共聚物质量比和有机相与水相体积比的影响。综合考虑DHA胶束的粒径、载药量与包封率，最佳制备工艺为使用二氯甲烷作为溶剂，聚合物与药物的质量比为1:8，有机相与水相的体积比为2:15;按照最佳工艺得到的DHA胶束平均粒径为(119.6±7.04)nm，平均载药量为(13.57±2.57)％，平均包封率为(94.23±2.61)％。冻干过程中，加入5％海藻糖能得到外观良好，复溶性好，粒径较小且包封率较高的冻干产品。
　　 第二部分:DHA胶束的表征
　　 采用核磁共振氢谱(1H NMR)验证聚合物的结构，根据聚乙二醇链段的分子量计算聚左旋乳酸链段的分子量;Malvem-3000Hs型激光粒度分析仪测定DHA胶束的粒径及其分布;采用透射电镜(TEM)负染法观察空白与载药胶束的形态特征;采用红外光谱(IR)比较空白胶束冻干品、DHA胶束冻干品和DHA与空白胶束的物理混合物的红外图谱，确证胶束的形成。
　　 结果显示:mPEG-PLLA嵌段共聚物各链段的数均分子量分别为5000和3200，购买的聚合物满足实验需要。制备的DHA胶束粒径范围为(110-130)nm。TEM清晰的显示出胶束的形态，既有球形核-壳结构的胶束，也有虫状胶束。DHA胶束疏水链段部分不被磷钨酸所染色呈现亮白色，亲水的PEG外壳吸附了水相中的部分磷钨酸，电镜下呈现灰色晕环。IR图谱中，空白胶束冻干品与DHA胶束冻干品的图谱基本一致，而物理混合物中显示出DHA的特征吸收峰，说明DHA确已包裹在嵌段共聚物胶束内部，载药胶束形成。
　　 第三部分:DHA胶束的体外性质探索
　　 采用芘探针法测定空白胶束的临界胶束浓度(CMC):配制一系列浓度的空白共聚物胶束溶液，加入一定量的芘，在37℃恒温水浴中放置5h，在避光条件下放置过夜。在发射光波长390nm处测定芘在333 nm与338nm处的激发光强度。以log(c，mg/ml)与芘在338 nm与333 nm处的荧光强度的比值(I338/I333)作图，曲线的拐点即为该共聚物CMC值。采用透析法，将DHA混悬液与DHA胶束溶液同时置恒温振荡箱中，比较在不同pH(pH为6.5、7.0与7.5)释放介质中，DHA胶束的释放曲线，并药物的累积释放进行拟合，对DHA药物释放机制进行初步研究。室温留样实验考察DHA胶束冻干品在常温放置条件下的长期稳定性。
　　 结果显示:空白胶束的CMC值为2.25×10-3mg/ml(即2.25mg/l，2.32×10-7mol/l)，这意味着实验中制备的聚合物胶束具有较好的耐稀释稳定性，载药后于稀释的环境中(如静脉给药)有好的稳定性。相同时间内，DHA胶束在pH=6.5的释放介质中，释放迅速而彻底;而相同释放介质中，DHA胶束释放速度高于DHA混悬液;在pH为6.5与7.0的释放介质中，DHA胶束中药物释放符合一级释放模型;在pH为7.5的释放介质中符合Higuchi释放方程。DHA药物从mPEG-PLLA聚合物胶束中释放不仅有扩散机制，同时也可能通过骨架溶蚀机制释放药物。室温留样实验表明，随着放置时间的延长，粒径逐渐变大，包封率逐渐变小，而外观与复溶性并没有大的变化。
　　 第四部分:DHA胶束体外对细胞的作用
　　 采用四甲基氮唑蓝法(MTT)法考察DHA胶束的对三种肿瘤细胞(人肝癌HepG2细胞、人口腔上皮癌KB细胞、人卵巢癌A2780细胞和一种正常细胞(人正常肝L02细胞)的作用，SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析。倒置荧光显微镜观察给药后A2780细胞与L02细胞的形态。
　　 结果显示:DHA混悬液与DHA胶束对HepG2细胞、KB细胞、A2780细胞与L02细胞的作用均呈显著的浓度依赖性，生存率随着药物浓度增大而降低。给药48小时后，DHA混悬液与DHA胶束对HepG2细胞的作用达到最大，IC50(μg/ml)值分别为3.00±1.85和2.45±2.16。给药72小时后，DHA混悬液与DHA胶束对KB细胞的IC50(μg/ml)值分别为6.98±0.32和5.32±0.28;对A2780细胞IC50(μg/ml)值分别为29.30±0.41与13.17±0.37。DHA胶束组对HepG2、KB与A2780细胞的IC50值均低于DHA混悬液组。倒置显微镜下观察，72h后，A2780细胞用药组的细胞萎缩变形;而L02细胞用药组的形态并无大的改变。
　　 第五部分:DHA胶束体内抗肿瘤作用
　　 实验中对20只BALB/c裸鼠进行造模，每只裸鼠皮下注射107个人肝癌HepG2细胞，待肿瘤体积长大到约110mm3后分成四组，开始尾静脉注射DHA混悬液与DHA胶束溶液给予治疗。每天给药，每两天记录一次裸鼠肿瘤体积值，持续14天后，处死并剥离肿瘤称重，观察各组肿瘤质量差异，SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析。
　　 结果显示:给药前各组裸鼠的活体肿瘤体积无显著性差异(F=0.052，P=0.983);给药14天后，各组裸鼠的肿瘤体积差异有显著性(F=10.357，P=0.003)，DHA胶束高剂量组的肿瘤体积小于模型对照组，也小于DHA胶束低剂量组。随着治疗时间的延长，各组裸鼠活体肿瘤的体积逐渐增大。DHA胶束高剂量组与DHA胶束低剂量组的离体肿瘤质量之间有显著性差异(P=0.028);DHA胶束高剂量组与模型对照组之间的离体肿瘤质量也有显著性差异(P=0.003)。DHA胶束高剂量组、DHA混悬液组与DHA胶束低剂量组抑瘤率分别为71.70％、40.25％与26.42％。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 双氢青蒿素抗肿瘤作用综述

1．2 嵌段共聚物胶束给药系统研究综述

1．3 立题依据与主要内容

第二章 DHA胶束制备工艺优化

2．1 材料与仪器

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 DHA胶束的表征

3．1 材料与仪器

3．2 方法与结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 DHA胶束的体外性质探索

4．1 材料与仪器

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 DHA胶束体外对细胞的作用

5．1 材料与仪器

5．2 方法

5．3 结果

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 DHA胶束裸鼠体内抗肿瘤作用

6．1 材料与动物

6．2 方法

6．3 结果

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 创新之处

7．3 研究展望

参考文献

附录

硕士期间发表的文章

致谢

声明

统计学证明