Tau蛋白过度磷酸化的同时神经元重新进入细胞周期

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常见的神经退行性疾病，其主要病理变化是细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和细胞外淀粉样老年斑(senile plaques，SP)。临床病理研究发现，AD患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的NFTs数量呈正相关，NFTs的主要蛋白成分为过度磷酸化的tau蛋白。
　　 Tau蛋白是神经细胞中的微管相关蛋白，其生理功能为促进微管组装和稳定微管结构，tau蛋白过度磷酸化过后失去上述生物学功能，并且自身聚合形成双螺旋丝和NFTs，导致神经元微管破坏、胞体-轴突营养物质运输及信息传递障碍和神经元退化死亡。引起tau蛋白异常过度磷酸化的机制是蛋白激酶活性升高和/或磷酸酯酶活性下降，研究显示cAMP-依赖性蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase，PKA)在tau蛋白异常过度磷酸化中起重要作用。Forskolin为PKA特异性激动剂，在体内激活PKA后，可以直接磷酸化tau从而产生过度磷酸化的tau蛋白，被PKA预磷酸化的tau蛋白更易被糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)和周期蛋白依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5，CDK5)磷酸化。
　　 神经元重新进入细胞周期是AD主要的神经病理学特征之一。中枢神经元通常被认为处于终末分化状态，意味着它们不再进入细胞周期。然而，越来越多的研究显示AD患者脑中的神经元存在细胞周期的重新进入，重新进入细胞周期将导致神经元死亡。AD脑中含有NFTs的神经元存在细胞周期调控因子(cyclinB、PCNA和Cdc2等)的异常表达与激活，cyclin D1是调节神经元离开G0期进入G1期的关键分子，AD患者脑中其水平升高，表明AD脑中含有NFTs的神经元存在细胞周期的重新进入，提示了tau蛋白过度磷酸化与神经元重新进入细胞周期之间可能的内在联系。
　　 第一部分Forskolin诱导培养的原代海马神经元tau蛋白过度磷酸化
　　 (一)目的
　　 探讨Forskolin诱导的原代海马神经元tau蛋白过度磷酸化。
　　 (二)材料与方法
　　 本部分研究以培养的新生1天SD大鼠原代海马神经元为实验对象，使用4μmol/L cAMP-依赖性蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase，PKA)的特异性激动剂Forskolin分别处理原代海马神经元0h、3h、6h、12 h和24 h，用免疫印迹和免疫荧光技术检测在上述不同时间点上tau蛋白Ser214、Ser396及Ser202/Thr205位点的磷酸化水平。用Image J图像分析软件对免疫印迹结果进行灰度分析，用SPSS13.0统计软件采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法对组间数据进行多重比较。实验重复三次用于统计分析，即样本量为3。
　　 (三)结果
　　 新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48 h，用4μmol/LForskolin处理0h、3h、6h、12h和24 h，进行免疫印迹和免疫荧光检测原代海马神经元tau蛋白的磷酸化水平，结果显示:tau蛋白Ser214位点的磷酸化在Forskolin作用6h和12h升高，其中6h时tau蛋白的磷酸化达到高峰(F=10.059，P＜0.005)，24 h下降至0h水平;tau蛋白Ser396位点的磷酸化在Forskolin作用6h时升高(F=4.813，P＜0.05)，12h时达到高峰(F=4.813，P＜0.005)，24 h时降至0h水平;tau蛋白Ser202/Thr205位点的磷酸化在Forskolin作用3h、6h、12h和24 h时均升高，其中12h时tau蛋白的磷酸化达到高峰(F＝2.720，P＜0.005)，24 h时下降至3h水平;Forskolin作用0h、3h、6h、12h和24 h的总tau蛋白水平之间没有差异(F=0.720，P＞0.05); Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位点磷酸化的tau和总tau均主要分布在胞质。
　　 (四)结论
　　 4μmol/L Forskolin诱导培养的原代海马神经元tau蛋白在Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化，其磷酸化高峰分别为Forskolin作用6h、12h和12h。
　　 第二部分Tau蛋白过度磷酸化的同时神经元重新进入细胞周期
　　 (一)目的
　　 探讨tau蛋白过度磷酸化与神经元重新进入细胞周期的关系。
　　 (二)材料与方法
　　 本部分研究以培养的新生1天SD大鼠原代海马神经元为实验对象，用4μmol/L cAMP-依赖性蛋白激酶A(cAMP-dependent proteinkinase，PKA)的特异性激动剂Forskolin处理原代海马神经元诱导tau蛋白过度磷酸化，采用免疫印迹法检测原代海马神经元细胞周期蛋白cyclin D1和cyclinB1，采用免疫荧光双标技术检测原代海马神经元Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位。用Image J图像分析软件对免疫印迹结果进行灰度分析，用SPSS13.0统计软件采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法对组间数据进行多重比较。实验重复三次用于统计分析，即样本量为3。
　　 (三)结果
　　 新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48 h，用4μmol/LForskolin处理6h和12h诱导tau蛋白过度磷酸化，应用DMSO作为溶剂对照，进行免疫印迹，检测原代海马神经元细胞周期蛋白cyclin D1和cyclinB1，结果显示:在4μmol/L Forskolin作用6h和12h，原代海马神经元细胞周期蛋白cyclinD1和cyclin B1的水平均升高(cyclin D1: F=433.106，P＜0.005; cyclin B1:F=39.135，P＜0.005)。新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48 h，用4μmol/LForskolin处理6h诱导tau蛋白过度磷酸化，进行免疫荧光双标，检测Ser214位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位，结果显示:4μmol/L Forskolin处理6h，tau蛋白Ser214位点的磷酸化水平增高，细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高，Ser214位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1存在共定位，Ser214位点过度磷酸化的tau蛋白和细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均主要分布在胞质。新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48 h，用4μmol/L Forskolin处理12h诱导tau蛋白过度磷酸化，进行免疫荧光双标，分别检测Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位，结果显示:4μmol/L Forskolin处理12h，tau蛋白Ser396和Ser202/Thr205位点的磷酸化水平均增高，细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高，Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均存在共定位，Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白以及细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均主要分布在胞质。
　　 (四)结论
　　 4μmol/L Forskolin诱导海马神经元tau蛋白过度磷酸化的同时，细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高，过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1存在共定位。

目录

摘要

第一章 Forskolin诱导培养的原代海马神经元tau蛋白过度磷酸化

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 结论

1．5 讨论

1．6 参考文献

第二章 Tau蛋白过度磷酸化的同时神经元重新进入细胞周期

2．1 引言

2．2 方法及材料

2．3 结果

2．4 结论

2．5 讨论

2．6 参考文献

综述

攻读硕士学位期间成果

致谢

声明

统计学证明