栖热菌属菌株Thermus thermophilus XM中耐热碱性磷酸酶的克隆、表达以及重组酶的性质研究

摘要

海洋是人类最后一块没有开发的疆域，海洋中的各种资源吸引着越来越多的科学工作者。海洋生物资源研究更是吸引着世界各国生物学家的注意。嗜热的微生物是海洋生物中一个重要的成员，对它们的研究已经成为国际热点。有证据表明嗜热菌是地球上形成的第一类生命形式，对他们的研究有重要的科学意义，同时对它们产生的各种酶的研究也具有各种工业和科学研究方面的意义。 本研究利用基因工程方法对分离到的栖热菌属的一菌株Thermus thermophilus XM的碱性磷酸酶进行了克隆、表达，对可溶的重组蛋白进行了Ni柱纯化。同时，对重组酶(rTAPase)的一些基本的酶学性质进行了测定。 实验表明Thermus thermophilus XM的AP基因的编码序列由1506bp组成，编码一个501个氨基酸残基的多肽，其分子量为54.7KDa，N端有一个27个氨基酸残基的信号肽。推测出的氨基酸一级结构与同属的其他菌株的AP具有高度保守性，与一些典型的中温AP和其它属的AP的对比表明，在这些AP中，它们的活性位点和金属结合位点具有高度保守性。该基因以N端加上一个6-His的形式在大肠杆菌中进行了表达。纯化得到的可溶重组蛋白的浓度为154mg/ml。对rTAPase的性质测定结果表明，该重组酶是一个高度耐碱的(最适反应pH12.0)、中度耐热的(最适反应温度在75-80℃范围内)在AP。其在80℃保温6小时后，活性仍然保留50％以上。作为一种金属酶，一些二价金属离子如Co2+，Mg2+，Mn2+和Fe2+等对rTAPase活性有促进作用，而另外一些金属离子如Cu2+，Ca2+，Zn2+和K+等对rTAPase活性有不同程度的抑制作用。两种表面活性剂SDS和Triton X-100对rTAPase具有强烈的抑制作用。在最适反应条件下，rTAPase催化水解对硝基苯磷酸二钠盐水解的Km值为0.034mM，着和其他的一些中温和高温的AP基本相同，表明rTAPase和其它来源的AP具有相近的催化能力。 嗜热细菌是耐热酶的主要来源，但是它们培养条件苛刻，不能大量培养，且天然酶的产量低。但是在中温酶中生产耐热酶就不会有以上问题。本研究描述了在中文菌中表达耐热AP的过程并且对重组酶性质进行了测定，为该酶的生产和应用奠定了基础

目录

声明

摘要

1前言

1.1 嗜热菌的研究进展

1.1.1嗜热菌的分类

1.1.2嗜热菌的生境

1.1.3嗜热菌的分类鉴定极其在生命起源中的地位

1.1.4嗜热菌的耐热机制及嗜热菌的应用

1.1.5栖热菌属(Thermus)嗜热菌的研究现状

1.2热稳定酶的研究进展

1.2.1热稳定酶的来源

1.2.2热稳定酶的耐热机制及热稳定酶耐热性的改造技术

1.2.3热稳定酶的特性和应用

1.2.4碱性磷酸酶的研究

1.2.5耐热碱性磷酸酶的研究

1.3本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料和用具

2.2常用溶液、培养基的配制

2.8方法

3结果和分析

3.1克隆及鉴定

3.2测序结果和序列比对

3.3重组质粒的表达、纯化

3.4重组蛋白的性质

4 讨论

5结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

附录

致谢