大鼠肝移植后NK1.1T淋巴细胞肝脏归巢的实验研究

摘要

目的：(1)建立大鼠原位肝移植模型，总结手术技巧和方法，为下一步实验提供稳定的动物模型。(2观察移植肝脏中NKl．1T细胞的归巢现象及其与Kupffer细胞和肝血窦内皮细胞的相互关系，初步阐明Kupffer细胞和肝血窦内皮细胞介导NKl．1T细胞归巢肝脏的作用机制。 方法：(1)用改良“二袖套法”建立大鼠原位肝移植动物模型，即肝上下腔静脉用缝合法连续吻合，门静脉、肝下下腔静脉用袖套法吻合，胆管用内支架法完成胆道重建。观察大鼠存活率和生存质量，总结手术技巧、经验和方法，掌握成熟稳定的建模技术。(2)按上述方法建立大鼠原位肝移植模型(LEW-BN)，实验分3组进行：正常对照组、Gdcl3预处理移植组(LEW-BN)及同种异基因移植组(LEW-BN)。Gdcl3预处理移植组采用Gdcl3进行预处理供体大鼠，具体方法是：获取供肝前以O．2％氯化钆连续两天经大鼠尾静脉注射，每次7mg／kg，第三天取供肝。正常对照组和同种异基因移植组采用0．9％NS预处理，方法同Gdcl3预处理移植组。所有进入实验组的受体大鼠必须能够稳定的存活7天及以上。每一组样本量为12只大鼠，随机选取其中的6只进行各项指标的检测，剩余的6只观察其存活情况。除观察大鼠存活率外，各组大鼠于术后第7d活杀动物，并按照以下方法进行实验指标的检测和观察： a．酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各样本大鼠血清次级淋巴细胞趋化因子(secondarylymphoid-tissuechemokine,SLC)的水平； b．取其肝脏分离KCs和NKl．1T细胞，直接在显微镜下用O．2％台盼兰染色进行活细胞计数，比较三组之间的数量差别； c．RT-PCR观察KCs膜表面分子CD54(ICAM-1)mRNA表达， d．RT-PCR观察NKl．1T细胞表面CDlla([FA-1)的表达； e．原位杂交检测移植肝脏中CD54mRNA表达； f.免疫组化检测移植肝脏中NF-r,B表达； g．观察移植肝脏的病理改变。 结果：(1)大鼠原位肝移植主要手术步骤所需时间稳定，具体时间如下：供肝切取30．3~1．7min，修整供肝14．2-4=1．5min，SHVC吻合12．54-1．Smin，PV吻合4．5~1．1min，无肝期19．4+1．2min，IHVC吻合3．5i-0．8min，胆道重建3．8+0．9rain。通过训练，能够建立起稳定的高质量的移植模型，在不使用任何免疫抑制剂的情况下，移植大鼠一周的总体存活率达到了100％。(2)NKl．1T细胞计数结果显示：对照组为5．24-1一×106，移植组为18．1~2．5×106,Gdcl3组为8．4：t：1．2x106，三组之间存在着显著差距。这一方面说明了肝移植后NKl．1T细胞肝脏归巢是客观存在的病理生理现象，另一方面也提示Kupffer细胞在NKl．1T细胞肝脏归巢的过程中起着一定的正性作用但并不是唯一的作用，还存在着其他介导归巢的作用机制。(3)血清SLC水平检测结果显示：对照组为52．054-1．¨2pg／ml，移植组为180．15+2．540pg／ml,Gdcl3组为80．42--L1．254pg／ml。三组之间差异显著。将SLC血清水平与NKl．1T细胞计数结果联系起来分析，我们可以发现二者之间存在着一定的正性相关性。这提示，在NKl．1T细胞肝脏归巢的过程中SLC也起着一定的正性作用。(4)移植组NKl．1T细胞LFA-mRNA高表达，KCs膜表面分子CD54mRNA呈高表达，肝血窦内皮细胞CD54mRNA亦高表达。Gdcl3组NKl．1T细胞LFA-lmRNA相对低表达，KCs膜表面分子CD54mRNA相对低表达，肝血窦内皮细胞CD54mRNA亦相对低表达。对照组基本无表达。这提示，在NKl．1T细胞肝脏归巢的过程中，CD54和LFA-1的相互作用可能起着重要的正性作用。(5)移植组肝组织NF-rd3表达明显增强，Gdcl3组相对低表达，对照组基本无表达。这提示，在NKl．1T细胞肝脏归巢的过程中，NF-rd3可能也起着促进作用，或者是其他某些因素通过活化NF-rd3而间接起着促进作用。(6)病理学检查发现移植组肝脏汇管区显著单核细胞和淋巴细胞浸润，Gdel3组汇管区较少单核细胞和淋巴细胞浸润，对照组基本无浸润。 结论： (1)、在大鼠原位肝移植模型中NKl．1T细胞肝脏归巢的现象是客观存在的病理生理现象； (2)、大鼠肝移植后NKl．1T细胞肝脏归巢J眼Kup脑细胞和肝血窦内皮细胞有关；更具体的讲，NKl．1T细胞肝脏归巢跟ICAM-1和LFA-1相互作用有关； (3)、ICAM-l和LFA-1的相互作用可能被次级淋巴细胞趋化因子(SLC)及其信号传导通路通过NIK活化NF-rd3而上调，同时也可能因为缺血再灌注损伤激活肝血窦内皮细胞NF-κB而上调。 本研究验证了大鼠原位肝移植模型中NK1.1T细胞肝脏归巢现象，初步探讨了归巢可能的分子机制。下一步将深入探讨归巢后的NK1.1T细胞在诱导移植肝脏免疫耐受方面的作用及其机制。

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摘要

前言

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

4.结论

参考文献

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文献综述:淋巴细胞归巢的研究进展

致谢

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