马巴贝斯虫Be82基因片段的克隆、表达及其在诊断中应用的研究

摘要

马巴贝斯虫是一种血液寄生虫，马属动物感染该寄生虫后，可引起一种血液原虫病，通常把它叫作马巴贝斯虫病。由于马巴贝斯虫危害大，难以根治，对国际马匹贸易产生很大影响，因此各国都将该病列为重要监测的马病之一。敏感、特异的血清学检测方法一直是各国学者研究的主要对象。 本研究采用人工合成马巴贝斯虫Be82A基因，然后再通过PCR扩增、酶切、连接方法构建了2个Be82基因片段和1个完整的Be82基因重组表达载体，并成功在融合表达载体pGEX-4T-11中进行了表达。经PCR鉴定，3个重组表达的Be82基因片段的大小分别为192bp、306bp和420bp，与预期的结果相符。经SDS-PAGE电泳，结果表明3个目的基因表达蛋白的大小分别为33KD、37KD和42KD。 经ELISA检测，3种融合表达的蛋白均能与马巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应，说明这3种表达蛋白都具有作为诊断用抗原的可能性。分别以这3种抗原为基础，建立ELISA方法，在小样品范围内进行测试，结果表明33KD蛋白的敏感性要高于37KD和42KD，从而确定选择33KD表达蛋白作为诊断用抗原来检测马巴贝斯虫病EUSA。 用本研究建立的ELISA试剂对出口马匹进行检测，与传统检测方法补体结合试验进行比对，结果表明两种方法的符合率为100％。说明本研究建立的ELISA具备替代补体结合试验的基础。 综上所述，本研究成功构建表达了Be82基因片段，并在国内首次筛选出敏感、特异的马巴贝斯虫病诊断用抗原。利用该抗原制备的ELISA可检测出马巴贝斯虫阳性动物，为我国进出口马属动物的检验提供了技术手段，解决了目前我国马巴贝斯虫病检测试剂依赖进口的局面，为我国自主生产马巴贝斯虫病检测试剂提供了可能性，该技术可广泛应用于马巴贝斯虫病的诊断、检疫、控制和净化，为我国马巴贝斯虫病的监测和流行情况的调查提供了技术支持。

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引言

第一章马巴贝斯虫Be82基因片段的克隆、表达与分析

1.1材料

1.2方法

1.2.1人工合成马巴贝斯虫Be82A基因序列

1.2.2引物的设计与合成

1.2.3重组质粒pGEX/Be82A的构建及鉴定

1.2.4重组质粒pGEX/Be82A+1的构建及鉴定

1.2.5重组质粒pGEX/Be82A+2的构建及鉴定

1.2.6重组菌的诱导表达

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.2.8表达蛋白的纯化

1.2.9采用ELISA方法对重组表达蛋白进行初步评价与研究

1.3结果

1.3.1人工合成马巴贝斯虫Be82A基因序列分析

1.3.2重组质粒pGEX/Be82A的构建与分析

1.3.3重组质粒pGEX/Be82A+1的构建与分析

1.3.4重组质粒pGEX/Be82A+2的构建与分析

1.3.5重组表达质粒鉴定结果与分析

1.3.6重组表达菌的诱导表达与分析

1.3.7包涵体的洗涤与纯化的分析

1.3.8表达蛋白初步评价结果与分析

1.4讨论

1.4.1人工合成Be82A基因的必要

1.4.2 Be82A基因的克隆与表达

1.4.3三种表达蛋白的初步评估

第二章基因片段重组表达产物在马巴贝斯虫诊断中初步应用的研究

2.1材料

2.2方法

2.2.1用33KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测标准血清

2.2.2用37KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测标准血清

2.2.3用42KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测标准血清

2.2.4用VMRD生产的马巴贝斯虫病竞争ELISA试剂盒检测标准血清

2.2.5用马巴贝斯虫病微量补体结合试验检测标准血清

2.2.6用33KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测被检马血清

2.2.7用VMRD竞争ELISA试剂盒检测被检马血清

2.2.8用马巴贝斯虫病微量补体结合试验检测被检马血清

2.3结果

2.3.1 33KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测标准血清的结果与分析

2.3.2 37KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测标准血清的结果与分析

2.3.3 42KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测标准血清的结果与分析

2.3.4 VMRD生产的马巴贝斯虫病竞争ELISA试剂盒检测标准血清的结果与分析

2.3.5马巴贝斯虫病微量补体结合试验检测标准血清的结果与分析

2.3.6 33KD表达蛋白包被的ELISA试剂盒检测60份被检马血清的结果与分析

2.3.7 VMRD竞争ELISA试剂盒检测60份被检马血清的结果与分析

2.3.8马巴贝斯虫病微量补体结合试验检测60份被检马血清的结果与分析

2.4讨论

2.4.1三种表达蛋白为马巴贝斯虫特异性蛋白

2.4.2 33KD蛋白与抗体发生反应的强度高于37KD和44KD

2.4.3与补体结合试验的比对试验

2.4.4与其他试剂盒的比对

2.4.5在小数量样本间的测试

结论

创新点

文献综述

参考文献

致谢

作者简历