溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的功能研究

摘要

Ⅲ型分泌系统（Type III secretion system，T3SS）是溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）中一个重要的致病因子，与细菌的致病性密切相关。病原菌粘附到宿主细胞表面后，通过T3SS直接将特异性效应蛋白注入宿主细胞内，改变宿主的各种生理功能，破坏宿主的组织结构，达到能在宿主体内生存和繁殖的目的。分子伴侣护航蛋白（chaperone escort protein）是最近鉴定的一种T3SS功能蛋白，其作用是一方面护航分子伴侣到相应的位置，使分子伴侣以正确的方式与效应蛋白结合；另一方面，在护航结束后，重新将分子伴侣释放出来以便下一轮的循环，从而保证分子伴侣的重复利用和效应蛋白的输出效率。
　　本研究选取T3SS系统中分子伴侣护航蛋白VscO进行研究，首先运用PCR技术扩增了vscO基因的全长序列，并对其进行了生物信息学分析。结果表明：vscO基因全长462 bp，编码153个氨基酸，理论分子量为18.43 kDa，理论pI值为9.22。BLAST分析发现溶藻弧菌VscO与副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）VscO氨基酸序列的同源性最高达86％。其次，采用Overlap PCR和同源重组技术，结合氯霉素（Cm）正向筛选和sacB基因蔗糖负向筛选，构建vscO基因无标记基因框内缺失突变株，研究了缺失株的各种致病相关的表型变化，以及vscO下游相关基因的表达调控变化。结果表明：vscO基因的缺失，没有明显影响溶藻弧菌的生长曲线、生物膜形成能力以及胞外蛋白酶活性。但是缺失株的泳动能力明显降低，对斜带石斑鱼（Epinephelus awoara）的致病性也明显减弱。同时vscO基因的缺失，使得T3SS中分子伴侣SycD与效应蛋白VopB、VopD在各个生长时期的mRNA表达量显著下调。所有的突变性状在互补株中几乎得以恢复，证明了突变性状是由vscO基因突变所产生。由此推测，在缺失VscO的情况下，分子伴侣SycD不能被护航到相应位置，导致了VopB和VopD不能被完全的转运到宿主细胞膜上来形成T3SS针孔。其结果是，溶藻弧菌的毒力和泳动力被衰减。
　　将溶藻弧菌vscO基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建原核表达质粒pET28-vscO，经优化表达条件、纯化后，获得大量目的蛋白。将原核表达的VscO蛋白免疫BALB/c级小鼠，制备了多克隆抗体，效价达1:40000。VscO蛋白两次免疫斜带石斑鱼后，用致病性溶藻弧菌HY9901进行人工感染试验，对斜带石斑鱼的免疫保护率为80%。ELISA检测发现，免疫斜带石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值（1:2048）。可见，溶藻弧菌分子伴侣护航蛋白VscO具有较好的免疫原性，能诱导小鼠产生较强的免疫应答，且对斜带石斑鱼具有一定的免疫保护作用。
　　通过RT-PCR方法，检测了不同生长时期，不同环境因子（温度、盐度和pH）对溶藻弧菌vscO基因表达的影响，以期初步了解vscO基因对环境因子的响应。结果表明：溶藻弧菌在生长对数期，温度为28℃，盐度为2%以及培养基起始pH为7.0时，vscO的表达量最高。该结果为今后进一步探讨养殖环境的变化对溶藻弧菌致病性的影响奠定了基础。

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1文献综述

1.1溶藻弧菌研究进展

1.2本研究的技术路线

1.3本研究的目的意义

2分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆和缺失株构建

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

3分子伴侣护航蛋白VscO的功能研究

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

4溶藻弧菌VscO蛋白的免疫原性和免疫保护性分析

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

5溶藻弧菌vscO基因在不同环境条件下的表达差异

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.4讨论

6结论

6.1溶藻弧菌分子伴侣护航蛋白VscO缺失株的构建

6.2溶藻弧菌分子伴侣护航蛋白VscO的免疫保护分析

6.3不同生长时期、不同环境因子下分子伴侣护航蛋白VscO的表达

参考文献

致谢

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