5-Fu对NKG2D配体MICA/B蛋白表达的调节作用

摘要

综合治疗是恶性肿瘤的重要治疗原则，除传统的化疗、放疗及手术等治疗方法外，免疫治疗的地位日益增强。自20世纪80年代末，Rosenberg等发现淋巴因子激活的自体杀伤细胞(lymp hokine activated killer，LAK)经大剂量IL-2体外扩增后，可治疗恶性肿瘤，由此提出了过继性免疫细胞治疗肿瘤的概念。NK细胞因不需活化即具有细胞毒作用，且抗瘤谱较广而被广泛研究，然而由于NK细胞的杀伤活性与IL-2的剂量高低、体内活化NK的数量及肿瘤表面MHC-I类抗原的表达高低有关，致使NK细胞在临床应用中的疗效不一。因而临床上一般用NK细胞免疫治疗联合化疗来达到治疗肿瘤更好的效果。研究表明，NK细胞表面有抑制性受体及活化性受体，通过调节其受体的表达可影响NK细胞的杀伤活性。NKG2D是NK细胞表面非常重要的活化性受体，NKG2D及其配体介导的杀伤活性对NK细胞的杀伤起着非常重要的作用。
　　 NKG2D配体为“诱导性”表面抗原，许多因素可以调控它的表达，如电离辐射、热休克、病毒感染等可使肿瘤细胞表面NKG2D的配体表达升高，增加NK细胞的活化信号，从而增强肿瘤细胞对NK细胞的敏感性。2009年Nice等发现了一个新的NKG2D配体表达调控机制-翻译后调控。他的研究结果表明小鼠的NKG2D配体Mult1具有较长的胞内段并含有6个赖氨酸，其在细胞表面的表达受泛素化和溶酶体降解的调控。当靶细胞受到紫外线照射后Mult1的泛素化水平降低，溶酶体降解减少，导致靶细胞表面Mult1表达的增加。并推测细胞表面跨膜蛋白MICA，MICB和RAET-1G在胞质尾存在赖氨酸残基-泛素化位点，很可能也存在着泛素化调控机制。
　　 因此本课题以人类宫颈癌细胞系HeLa为模型，研究抗肿瘤药5-Fu对HeLa细胞的NKG2D配体MICA，MICB表达及HeLa细胞对NK92细胞杀伤敏感性的影响，并探讨MICA胞内段对MICA在HeLa细胞表面表达的影响，为临床肿瘤化疗联合NK细胞治疗肿瘤提供实验依据。
　　 研究内容：1.5-Fu对HeLa细胞NKG2D配体MICA，MICB表达及HeLa细胞对NK92细胞杀伤敏感性的影响。2.MICA全长及胞内段缺失突变体的克隆和表达载体的构建。3.5-Fu及蛋白酶体抑制剂MG132对表达MICA全长及胞内段缺失突变体的HeLa细胞表面NKG2D配体MICA表达的影响。
　　 研究方法：不同浓度的5-Fu处理HeLa细胞，在不同时间点用半定量PCR及荧光定量PCR和流式细胞术分别检测HeLa细胞的NKG2D配体MICA与MICB在RNA和蛋白水平的表达变化。然后用NKG2D抗体封闭NK92细胞的NKG2D受体及用MICA，MICB抗体分别封闭HeLa细胞表面的NKG2D配体MICA，MICB，用MTT法检测封闭前后HeLa细胞对NK92细胞杀伤的敏感性的变化。分别扩增MICA全长及MICA截短体基因，将其插入真核表达载体pFLAG-CMV-2中，构建MICA全长及MICA截短体的表达载体，分别转染HeLa细胞，用DNA损伤药物5-Fu作用24小时，蛋白酶体抑制剂MG132作用6小时，用流式细胞术检测细胞表面MICA的表达变化。
　　 结果: 5-Fu作用于HeLa细胞24小时后，半定量RT-PCR结果显示MICA及MICB的表达随5-Fu作用浓度增加(2.5至40μg/ml)逐渐增高。40μg/ml5-Fu的作用效果随着作用时间的延长(0至24 h)而增加。荧光定量PCR结果显示5-Fu可使HeLa细胞MICA和MICB的表达分别上调到原来的1.8倍和1.4倍，而流式检测结果表明细胞表面的MICA表达增加，MICB不变，而且MICA的增加主要依赖于未凋亡细胞的表达。杀伤实验结果显示5-Fu可增加NK92细胞对HeLa细胞的杀伤率，杀伤作用可部分被NKG2D抗体、MICA抗体抑制，MICB抗体没有抑制作用。构建了含有MICA全长和MICA胞内段缺失突变体的真核表达载体MICA全长-pFLAG-CMV-2，MICA截短体-pFLAG-CMV-2，分别转染HeLa细胞，并用5-Fu和蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，流式结果显示转染MICA截短体，5-Fu作用后HeLa细胞表面MICA表达上调，MG132作用后，HeLa细胞表面MICA表达不变，而转染MICA全长，5-Fu作用后MICA表达变化趋势相反。
　　 结论: 5-Fu可提高HeLa细胞NKG2D配体MICA/B在mRNA水平的表达，并具有剂量和时间效应。5-Fu能够上调HeLa细胞表面NKG2D配体MICA的表达，增强HeLa细胞对NK92细胞杀伤的敏感性，而HeLa细胞表面MICB表达没有明显变化，MICA/B在细胞表面表达的差异可能与是否含有泛素化位点的胞内段有关。提示化疗联合NK细胞免疫治疗宫颈癌可能产生协同作用，提高治疗效果，胞内段存在与否对MICA在HeLa细胞表面表达有影响，具体机制还需进一步的实验进行验证。