人鼻病毒C15型2A蛋白酶的结构研究

摘要

人鼻病毒(human rhinoviruses，HRVs)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，是引起人类上呼吸道炎症最常见的病毒病源之一。在Pelon等人于1956年利用猴肾细胞在感冒病人的鼻咽灌洗液中发现第一株HRV以来，已发现的病毒血清型超过150种。同时一些交叉性中和试验也表明，HRV没有群抗原，相互之间无交叉免疫或只有较弱的交叉免疫，且目前亦没有十分有效的疫苗药物出现，所以说对HRV的研究是很有必要的。
　　HRV的基因组编码一条多聚蛋白，该多聚蛋白随后在自身蛋白酶的切割下形成成熟蛋白。其中，非结构蛋白2A和3C在病毒多聚蛋白的加工过程中起着重要的作用。在肠道病毒中，2A蛋白酶在病毒衣壳蛋白VP1的羧基端和2A蛋白酶的氨基酸之间的位置进行切割，从而将病毒的结构蛋白前体和非结构蛋白前体分开。肠道病毒中的2A蛋白酶具有多种功能，一方面，2A蛋白酶不仅能够将病毒的结构蛋白前体和非结构蛋白前体分割开来，帮助病毒蛋白的成熟;另一方面，2A蛋白酶还可以切割真核翻译起始因子4G(eIF4G)，从而影响宿主细胞的蛋白表达。
　　正是由于2A蛋白酶在HRV的整个生命过程中具有如此重要的作用，于是展开对HRV中的一种血清型C15型2A蛋白酶的研究，通过其晶体结构进一步了解其发挥作用的机理。将HRVC15型的2A蛋白酶的基因克隆到pGEX-6P-1载体，转入E.coli BL21(DE3)进行表达。所收集到的菌体经超声破碎、GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析后获得纯度95％的蛋白。将蛋白浓缩至10mg/mL后进行晶体的初步筛选。约两周后发现多个条件下均有晶体长出。经过挑选发现最佳结晶条件是0.2M Potassium chloride，0.1M Magnesium acetate tetrahydrate，0.05M Sodium cacodylate，10％w/v PEG8000。对其进行数据的收集，所用光源为日本高能物理研究所(National Labortory for High Energy Physics)KEK同步辐射加速器光子工厂(Photon Factory)，晶体分辨率达到2.6(A)。经过分析数据，得知属于C2221空间群，晶胞参数为a=80.992(A)，b=85.370(A)，c=208.908(A)，α=90°，β=90°，γ=90°。使用CVA162A蛋白酶的结构(PDB code:4MG3)作为初始模板，利用分子置换法解析HRVC15-2A蛋白酶的结构，计算蛋白晶体中的马修斯系数(Matthews Coefficiency)确定了晶体一个不对称单位中含有4个分子。经过后续对结构的解析与修正，成功将HRVC15型的2A蛋白酶的结构解析出来。HRVC15-2A蛋白酶的三维晶体结构主要是由蛋白氨基端的4个β片层以及蛋白羧基端的6个β片层构成的β桶结构构成。HRVC15-2A蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，通过与同源蛋白序列对比，确定其酶活中心由His18，Asp34和Cys105这三个高度保守的氨基酸残基构成。
　　由于2A蛋白酶在人鼻病毒复制、加工过程中的重要作用，该实验研究为抗人鼻病毒药物的研发提供了一定的理论基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．1 人鼻病毒的流行病学研究及发病机理

1．1．2 人鼻病毒的临床症状、检测方法及治疗

1．2 人鼻病毒简介

1．2．1 人鼻病毒的分子生物学背景及分类

1．2．2 肠道病毒的基因组结构

1．2．3 肠道病毒的结构蛋白

1．2．4 肠道病毒的非结构蛋白

1．3．1 半胱氨酸蛋白酶简介

1．3．2 肠道病毒2A蛋白酶的研究进展

1．4．1 研究蛋白质结构的技术简介

1．4．2 蛋白质的表达与纯化

1．4．3 蛋白质的结晶

1．4．4 蛋白晶体衍射数据的收集与处理

1．4．5 晶体结构的解析与修正

1．5 HRV C15-2A蛋白的研究意义和方法

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒、基因、菌种

2．1．2 主要实验仪器及工具

2．1．3 主要试剂

2．1．4 常用培养基及缓冲液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 HRVC15-2A重组质粒的构建及鉴定

2．2．2 HRVC15-2A 的表达与纯化

2．2．3 HRVC15-2A蛋 白的结晶

2．2．4 数据收集与HRVC15-2A晶体的结构解析

3 结果与讨论

3．2．1 HRVO15-2A蛋白的生物学信息

3．2．2 融合蛋白的试表达

3．2．4 HRVC15-2A蛋白酶的阴离子交换层析

3．2．5 HRVC15-2A蛋白酶的凝胶过滤层析

3．3 HRVC15-2A蛋白酶晶体生长的筛选与优化

3．4 数据收集与HRVC15-2A晶体的结构解析

3．4．2 HRVC15-2A蛋白晶体的结构解析与修正

3．5 HRVC15-2A蛋白的晶体结构及结构分析

3．5．1 HRVC15-2A蛋白的整体结构分析

3．5．2 HRVC15-2A蛋白酶的酶活中心

3．5．3 2A蛋白酶中金属锌离子的结合位点

3．5．4 与同源结构的比较

4 结论

5 展望

参考文献

7 论文发表情况

致谢

附录