硒酸壳聚糖诱导人肺癌A549细胞凋亡机制的研究

摘要

本文以人肺癌A549细胞为研究对象，通过将硒酸壳聚糖与A549细胞共培养，研究其对A549细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用的机理。通过MTT法、流式细胞术和二维电泳技术等从细胞形态学的变化、细胞周期的变化、凋亡通路的研究和差异蛋白的变化等方面考察了硒酸壳聚糖对A549细胞的影响。
　　首先，对硒酸壳聚糖诱导A549细胞凋亡的现象进行研究。MTT实验结果表明，随着硒酸壳聚糖浓度的增加和培养时间的延长，其对A549细胞的增殖抑制作用逐渐增强，在200μg/mL的硒酸壳聚糖作用A549细胞48 h后，抑制率达到77％;经过硒酸壳聚糖作用后细胞形态发生明显的变化;Hoechst33342/PI双染和DAPI染色可以观察到硒酸壳聚糖作用A549细胞后，细胞出现体积缩小、核质分离、凋亡小体等典型的凋亡现象;AnnexinⅤ-FITC/PI双染结果表明，经过硒酸壳聚糖作用A549细胞不同时间后，细胞逐渐从早期凋亡向晚期凋亡转变;细胞周期的研究结果表明硒酸壳聚糖能够将A549细胞阻滞在S期。
　　其次，研究了硒酸壳聚糖诱导A549细胞凋亡的信号途径。通过流式细胞术发现，细胞钙离子浓度升高、活性氧水平升高、MPTP通道开、线粒体膜电位降低，结果表明硒酸壳聚糖是通过线粒体途径诱导A549细胞凋亡的。
　　再次，通过SDS-PAGE、二维电泳技术分析了硒酸壳聚糖作用A549细胞48 h后的全蛋白图谱，发现了14个具有表达差异的蛋白点，其中11个蛋白点的表达量下调，3个蛋白点表达量上调。通过MALDI-TOF-MS/MS鉴定，共成功鉴定出5个差异表达蛋白，表达量上调有phospholipase C-alpha，prohibitin isoform1，表达量下调的有annexin A4, anterior gradient protein2 homolog precursor,10 kDa heat shock protein。这5个蛋白点均与细胞的线粒体途径相关。
　　综上所述，硒酸壳聚糖能够有效的抑制A549细胞的增殖并通过线粒体途径诱导其凋亡，是一种很有潜力的抗癌活性物质。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 壳聚糖

1．1．1 壳聚糖介绍

1．1．2 壳聚糖的生物学功能

1．2 硒化合物及其抗癌作用

1．2．1 硒多糖

1．2．2 硒蛋白

1．2．3 硒核酸

1．3 肺癌概述

1．3．1 肺癌的发病机理

1．3．2 肺癌的治疗现状

1．4 肿瘤细胞凋亡概述

1．4．1 细胞坏死与凋亡的区别

1．4．2 细胞凋亡的调控因素

1．4．3 细胞凋亡途径

1．5 蛋白质组学研究现状

1．5．1 蛋白质组学的概念

1．5．2 蛋白质组学研究的主要技术

1．5．3 双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用

1．6 本课题研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 硒酸壳聚糖的制备

2．2 主要方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 MTT法检测硒酸壳聚糖对A549细胞生长的抑制作用

2．2．3 硒酸壳聚糖共培养的A549细胞的形态学变化

2．2．4 Hoechst／PI双染观察与硒酸壳聚糖共培养的A549细胞的凋亡情况

2．2．5 荧光显微镜观察细胞学形态变化

2．2．6 Annexin V-FITC／PI试剂盒检测A549细胞凋亡情况

2．2．7 流式细胞仪检测硒酸壳聚糖对A549细胞周期的影响

2．2．8 罗丹明123(Rh123)染色检测细胞线粒体内跨膜电位的变化

2．2．9 硒酸壳聚糖诱导A549细胞MPTP的开放

2．2．10 细胞钙离子浓度测定

2．2．11 细胞内活性氧含量的检测

2．2．12 SDS-PAGE电泳检测细胞蛋白变化

2．2．13 二维电泳分析硒酸壳聚糖作用A549细胞前后差异蛋白质组学的研究

2．2．14 统计分析

3 结果与分析

3．1 MTT法检测壳聚糖对A549细胞的增殖抑制作用

3．2 倒置相差显微镜观察细胞学形态变化

3．3 Hoechst／PI双染观察与硒酸壳聚糖共培养的A549细胞的凋亡情况

3．4 DAPI染色观察细胞形态变化

3．5 Annexin V-FITC／PI检测A549细胞凋亡情况

3．6 流式细胞术检测A549细胞周期变化与凋亡

3．7 Rh123染色检测A549细胞线粒体内跨膜电位的变化

3．8 硒酸壳聚糖诱导A549细胞MPTP的开放

3．9 细胞钙离子浓度测定

3．10 细胞内活性氧含量的检测

3．11 SDS-PAGE分析A549凋亡前后蛋白变化

3．12 二维电泳结合MALDI-TOF-MS／MS分析结果

3．12．1 二维电泳结果

3．12．2 差异表达蛋白MALDI-TOF-MS／MS质谱分析及鉴定

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读学位期间发表论文情况

致谢