嘧啶核苷产生菌的构建及发酵优化

摘要

嘧啶核苷包括尿苷和胞苷，它们是RNA的组成成分，在一切生物体的生命活动及代谢过程中均占有重要地位。近年来，它们被用作生产抗病毒抗肿瘤药物的中间体，如碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)，三磷酸胞苷(CTP)、阿糖胞苷(Ara-CR)、环胞苷(Cyclo C)、胞二磷胆碱(CDP-Choline)等，发挥出重大的医药价值。利用微生物发酵法生产嘧啶核苷具有诸多优势，但国内尚无应用于工业化生产的高产菌株。本文基于代谢工程理论对菌种的选育进行了研究，并采用统计学方法对发酵培养基进行了优化，最终使菌株嘧啶核苷积累量得以大幅提升，为工业化生产提供了借鉴和指导。
　　以野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株为出发菌株，通过PCR技术扩增其基因组上胞苷脱氨酶编码基因cdd的上下游各约500 bp的同源臂，通过重叠PCR拼接后，与载体pKS1连接，构建出重组质粒pKS1Δcdd。将该质粒电转化入168菌株，利用质粒的温敏特性，通过同源重组敲除了cdd基因，阻断了胞苷向下代谢为尿苷的代谢流，构建出菌株Bacillus subtilis PYR1。该菌株具备积累两种嘧啶核苷的可能，为下一步菌种选育打下了基础。
　　通过与天津大学化工学院代谢工程室合作，以菌株PYR1为受体菌株，构建了一系列的基因工程菌株。利用摇瓶发酵对这些菌株进行产苷性能测试，并考察每个关键基因的改造对菌株产苷的影响。结果主要如下: hom基因和pyrR基因的敲除使菌株对于嘧啶核苷的积累从无到有，但有较多副产物尿嘧啶的积累;pdp基因和nupC基因的敲除进一步提高了嘧啶核苷的积累量，尿苷产量提高了1.43倍，胞苷产量提高了0.27倍，且副产物尿嘧啶的积累量降低了46.9％;野生型和突变型prs基因的过表达均对菌株产嘧啶核苷具有正影响，虽然胞苷积累量提升幅度不大，但尿苷积累量分别提高了31.93％和74.79％，后者效果优于前者，此外，副产物尿嘧啶积累量极少;pyrAB基因的定点突变增大了嘧啶合成通路，尿苷产量提高了76.44％，胞苷产量提高了16.22％。这些工作也明确了后续菌种选育的任务和方向。通过对发酵结果各项参数的比较，筛选出一株性能良好的菌株PYR5，以此为出发菌株，进行下一步的工作。
　　以尿苷产量为响应值，用响应面法对菌株PYR5产嘧啶核苷的发酵培养基进行了优化。首先，通过PB实验确定了对产苷影响显著的三个因素:酵母粉、豆粕水解液和谷氨酸钠。然后，利用最陡爬坡实验逼近响应面分析的最佳区域;最后，通过中心复合实验和响应面分析确定了三个显著因素的最佳浓度:酵母粉25.6 g/L，谷氨酸钠25.2 g/L，豆粕水解液40.9 mL/L，此时尿苷产量的预测值为13.76g/L。通过模型验证实验发现，尿苷的实际产量为13.52 g/L，与模型预测值非常接近，并且比初始培养基提高了164.1％;胞苷产量为0.78 g/L，提高了73.33％。此外，在优化的培养条件下，菌体生物量、葡萄糖消耗量、葡萄糖转化率及单位菌体产苷量均大幅度提升，说明此条件更适于菌体的生长及产苷。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 嘧啶核苷概述

1．1．1 结构及理化性质

1．1．2 用途

1．1．3 测定方法

1．2 嘧啶核苷的生产方法

1．2．1 RNA水解法

1．2．2 化学合成法

1．2．3 微生物发酵法

1．3 嘧啶核苷的生物合成及代谢调节机制

1．3．1 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的从头合成途径

1．3．2 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的补救合成途径

1．3．3 pyrR编码的阻遏蛋白介导的操纵子转录弱化调控

1．3．4 氨甲酰磷酸合成酶的变构调节

1．3．5 pyrG基因的转录弱化调控

1．3．6 UMP激酶

1．3．7 5’-核苷酸酶

1．4 发酵培养基优化策略

1．5 嘧啶核苷产生菌的育种策略及育种实例

1．5．1 育种策略

1．5．2 育种实例

1．6 立题背景及研究内容

1．6．1 立题背景

1．6．2 本论文主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 引物

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要溶液

2．1．6 主要培养基

2．2 实验方法

2．2．1 枯草芽孢杆菌基因组DNA的小量提取

2．2．2 质粒DNA的小量提取

2．2．3 目的基因的扩增

2．2．4 DNA的酶切

2．2．5 DNA的连接

2．2．6 琼脂糖凝胶电泳

2．2．7 DNA的回收纯化

2．2．8 大肠杆菌化转感受态细胞的制备及转化

2．2．9 枯草芽孢杆菌电转感受态细胞的制备及转化

2．2．10 枯草芽孢杆菌发酵生产嘧啶核苷的培养方法及分析检测方法

3 结果与讨论

3．1 Bacillus subtilis 168菌株cdd基因的敲除

3．1．1 同源臂的扩增

3．1．2 重组质粒pKS1Δcdd的构建

3．1．3 cdd基因缺失突变株的构建

3．1．4 小结

3．2 嘧啶核苷基因工程菌的摇瓶发酵

3．2．1 hom和pyrR基因的敲除对菌株产苷的影响

3．2．2 pdp和nupC基因的敲除对菌株产苷的影响

3．2．3 野生型及突变型prs基因的过表达对菌株产苷的影响

3．2．4 pyrAB基因的定点突变对菌株产苷的影响

3．2．5 小结

3．3 响应面法优化发酵培养基

3．3．1 PB(Plackett-Burman)设计筛选影响产苷的显著因素

3．3．2 最陡爬坡实验寻找响应面分析中心点

3．3．3 利用CCD进行响应面分析

3．3．4 模型的验证

3．3．5 小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 研究生期间发表论文情况

致谢