葡萄酒酿造过程中双乙酰的控制

摘要

双乙酰是葡萄酒酿造过程中酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵的副产物，当双乙酰浓度较高时，会产生令人生厌的馊饭味。在酵母酒精发酵过程中，双乙酰可以被还原为乙偶姻，进一步还原成2，3-丁二醇。本课题对双乙酰还原途径中的关键基因BDH1和BDH2进行了深入研究，利用基因工程手段构建重组葡萄酒酵母菌株，并对葡萄酒发酵条件进行了优化，以降低葡萄酒中双乙酰的含量。主要研究内容如下:
　　(1)对实验室保藏的5株葡萄酒酵母(Saccharomyces uvarum)以耐酒精、耐SO2、耐高糖和发酵性能为指标进行了比较，筛选得到了一株发酵性能优良的葡萄酒酵母WY1作为出发菌株。
　　(2)在葡萄酒发酵后期加入蔗糖，促使酵母产生二次发酵以降低双乙酰的含量。通过葡萄酒发酵实验得出:加糖二次发酵的最适加糖量为28g/L，与常规苹-乳发酵相比，加糖二次发酵使双乙酰含量降低了29.87％。
　　(3)利用基于PCR技术的同源重组，于葡萄酒酵母WY1中分别敲除基因BDH1和BDH2，验证两基因对双乙酰还原效果的影响，构建转化子WY1△1和WY1△2。葡萄酒发酵实验表明，WY1△1和WY1△2分别使双乙酰含量提高了37.15％和25.88％。
　　(4)利用基于PCR技术的同源重组和Cre/loxP报告基因挽救系统，构建BDH1和BDH2基因的过表达菌株WY1-1（过表达BDH1基因）、WY1-2（过表达BDH2基因）和WY1-12（同时过表达BDH1和BDH2基因）。通过三种葡萄酒发酵实验，测定双乙酰的含量，得出结果如下:在常规葡萄酒发酵实验中，WY1-1、WY1-2和WY1-12的双乙酰含量比出发菌株分别降低了28.05％、26.0％和31.05％;苹-乳发酵实验中，与出发菌株WY1相比，WY1-1、WY1-2和WY1-12分别使双乙酰含量降低了31.01％，23.88％和43.17％;加糖二次发酵实验中，WY1-1、WY1-2和WY1-12发酵后双乙酰含量分别降低了39.87％，33.42％和46.71％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 葡萄酒概述

1．1．1 葡萄酒的营养价值

1．1．2 葡萄酒的酿造工艺

1．1．3 葡萄酒中风味物质的概况

1．2 葡萄酒中双乙酰的形成和控制

1．2．1 双乙酰简介

1．2．2 葡萄酒中双乙酰的代谢

1．3 低产双乙酰酿酒酵母菌株的选育

1．4 本课题的立题依据和研究内容

1．4．1 本课题的立题依据

1．4．2 本课题的研究内容

2 材料和方法

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 主要培养基

2．1．5 主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 质粒构建

2．2．2 重组菌株的获得和验证

2．2．3 实时荧光定量PCR

2．2．4 KanMx筛选标记的去除

2．2．5 发酵实验

2．3 分析方法

2．3．1 双乙酰含量的测定

2．3．2 乙偶姻和2,3-丁二醇含量的测定

2．3．3 还原糖的的测定

2．3．4 酒精度的测定

2．3．5 总酸测定

2．3．6 总酯测定

2．3．7 发酵速度的测定

2．3．8 生长曲线的测定

2．3．9 风味物质测定

3 结果和讨论

3．1 出发菌株的筛选

3．1．1 耐受性试验

3．1．2 葡萄酒酿造试验

3．1．3 小结

3．2 加糖二次发酵试验

3．2．1 不同加糖量对葡萄酒残糖量和酒精度的影响

3．2．2 加糖二次发酵与苹-乳发酵双乙酰含量比较

3．2．3 小结

3．3 基因BDH1／BDH2对双乙酰含量的影响

3．3．1 基因BDH1／BDH2敲除菌株的获得

3．3．2 转化子WY1Δ1和WY1Δ2对双乙酰含量的影响

3．3．3 小结与讨论

3．4 基因BDH1／BDH2过表达菌株的构建

3．4．1 基因BDH1／BDH2过表达载体的构建

3．4．2 基因BDH1／BDH2过表达菌株的获得

3．4．3 基因过表达菌株生长曲线的测定

3．4．4 基因过表达菌株转录水平的测定

3．4．5 小结

3．5 葡萄酒发酵实验

3．5．1 葡萄酒常规发酵实验

3．5．2 苹-乳发酵实验

3．5．3 加糖二次发酵实验

3．5．4 小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表的论文

致谢