耐酸和耐热苏氨酸菌株构建

摘要

L-苏氨酸是人体必需氨基酸之一，是构成蛋白的重要组成部分，广泛应用于食品、饲料和医疗等方面。大肠杆菌发酵过程中，维持较低的pH和较高的发酵温度，可以节约流加的液氨和冷却水用量。若发酵液在较低pH时放罐，对于浓缩、等电结晶工艺来讲，可以节省中和所用的硫酸。因此，发酵过程pH和温度的控制有利于降低氨基酸生产过程中的能源消耗。
　　本文对大肠杆菌耐酸系统(ARs)进行分子改造，使大肠杆菌在酸性环境生存下来;对HSP20小热激蛋白、四氢嘧啶合成途径的引入，可以较大程度提高了大肠杆菌的耐热性能;从而使L-苏氨酸高产菌E.coli THRD在低pH、高温条件下有更高的L-苏氨酸产量。
　　以L-苏氨酸高产菌THRD为出发菌株，利用大肠杆菌的AR2或AR3耐酸系统进行分子改造，构建菌株THRD（pTrc99a-gadBC）、THRD araABD∷gadBC、THRD(pTrc99a-LGOX)、THRD（pTrc99a-arcA）、THRD araABD∷arcA。对耐酸改造菌株进行发酵验证，在5L分批补料发酵过程中，发酵初始pH7.0，在发酵前中期维持pH7.0，在发酵后期24 h左右，停止流加氨水，pH降到6.0以前不调节pH。pH降到6.0之后，维持pH6.0发酵。发酵结束时，THRD(pTrc99a)产量达到100±1 g/L，糖酸转化率32.9％; THRD(pTrc99a-gadBC)、THRD(pTrc99a-arcA)、THRD(pTrc99a-LGOX)的L-苏氨酸产量达到106±2 g/L、115±3 g/L、110±2 g/L，糖酸转化率达到34.7％、36.9％、36.5％，相较于THRD(pTrc99a)的产量和菌体糖酸转化率分别提高了分别提高了6.0％、15.0％、10.0％和5.6％、12.3％、10.9％。THRD araABD∷gadBC、THRD araABD∷arcA菌株发酵12h后，生物量增长速率、L-苏氨酸的生成速率明显减低，菌株增长缓慢。几株耐酸改造苏氨酸生产菌，发酵结果显示，AR2耐酸系统和AR3耐酸系统的改造有利于在酸性条件发酵L-苏氨酸的高产。
　　以L-苏氨酸高产菌THRD为出发菌株，对耐热因子进行分子改造，构建菌株THRD(p Trc99a-ectABC)、THRD（pBV220-hsp20）。对耐热改造菌株，在5L分批补料发酵过程中，发酵初始温度37℃，在发酵前中期维持温度37℃，在发酵12 h-14h左右，OD600(30-35)，调整温度为40℃，维持温度40℃发酵。发酵结束后，THRD(pBV220-hsp20)苏氨酸产量达到129 g/L，糖酸转化率达到37.1％，相较于THRD(pBV220)菌株的L-苏氨酸产量和菌体糖酸转化率较原菌分别提高了7.5％和6.9％;THRD（pTrc99a-ectABC）的生物量是15.58 g DCW/L，THRD(pTrc99a)的生物量是11.97 g DCW/L。THRD（pTrc99a-ectABC）苏氨酸产量达到125 g/L，糖酸转化率达到40.3％，相较于THRD(pTrc99a)菌株的L-苏氨酸产量和菌体糖酸转化率较原菌分别提高了9.60％和11.14％。
　　表明ectA、ectB、ectC基因，hsp20基因的过表达，有利于增加菌株在高温条件下发酵单位发酵时间内L-苏氨酸的产量。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 引言

1．2 L-苏氨酸的理化性质及应用

1．2．1 L-苏氨酸的理化性质

1．2．2 L-苏氨酸的应用

1．3 L-苏氨酸的生产方法及生产概况

1．3．1 L-苏氨酸的生产方法

1．3．2 L-苏氨酸生产概况

1．4 国内外直接发酵法生产L-苏氨酸的研究进展

1．5 大肠杆菌的耐酸系统(ARs)

1．6 AR2系统的改造

1．6．1 谷氨酸脱羧酶

1．6．2 谷氨酸转运蛋白GadC

1．7 谷氨酸氧化酶LGOD

1．8 AR3系统的改造

1．8．1 精氨酸脱亚胺酶

1．9 大肠杆菌耐热性的改造

1．10 立题背景及主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要溶液

2．2．4 培养基

2．2．5 抗生素

2．3 实验方法

2．3．1 质粒的小剂量提取

2．3．2 DNA纯化回收

2．3．3 大肠杆菌基因组的提取

2．3．4 大肠杆菌化学转化法感受态的制备及转化实验

2．3．5 大肠杆菌电转化法感受态的制备及转化实验

2．3．6 PCR扩增

2．3．7 琼脂糖凝胶电泳

2．3．8 质粒的构建

2．3．9 利用Red同源重组基因敲除方法

2．3．10 高效液相色谱法测定发酵液中的氨基酸含量

2．3．11 高效液相色谱法测定发酵液中的有机酸含量

2．3．12 大肠杆菌发酵L-苏氨酸的培养条件及分析测定方法

3 结果与讨论

3．1 大肠杆菌AR2系统的改造

3．1．1 大肠杆菌THRD(pTrc99a-gadBC)的构建

3．1．2 酸性条件下THRD(pTrc99a-gadBC)菌株生产L-苏氨酸的影响

3．1．3 THRD araABD∷gadBC菌株的构建

3．1．4 酸性条件下THRD araABD∷gadBC菌株生产L-苏氨酸的影响

3．1．5 大肠杆菌THRD(pTrc99a-LGOX)的构建

3．1．6 酸性条件下THRD(pTrc99a-LGOX)菌株生产L-苏氨酸的影响

3．1．7 AR2系统改造对生产菌发酵L-苏氨酸影响的讨论

3．2 大肠杆菌AR3系统的改造

3．2．1 大肠杆菌THRD(pTrc99a-arcA)的构建

3．2．2 酸性条件下THRD(pTrc99a-arcA)菌株生产L-苏氨酸的影响

3．2．3 THRD araABD∷arcA菌株的构建

3．2．4 酸性条件下THRD araABD∷arcA菌株生产L-苏氨酸的影响

3．2．5 AR3系统改造对THRD菌株酸性条件下生产L-苏氨酸影响的讨论

3．3 苏氨酸生产菌耐热系统的改造

3．3．1 大肠杆菌THRD(pTrc99a-ectABC)的构建

3．3．2 高温条件下THRD(pTrc99a-ectABC)菌株生产L-苏氨酸的影响

3．3．3 大肠杆菌THRD(pBV220-hsp20)的构建

3．3．4 高温条件下THRD(pBV220-hsp20)菌株生产L-苏氨酸的影响

3．3．5 THRD ybeM∷hsp20菌株的构建

3．3．6 高温条件THRD ybeM∷hsp20菌株生产L-苏氨酸的影响

4 结论

5 展望

参考文献

7 研究生期间所发表论文情况

致谢