一种耐酸性苏氨酸生产菌及其构建方法与应用

摘要

本发明提供了一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，并通过该方法获得的耐酸性苏氨酸生产菌可用于制备苏氨酸，利用谷氨酸氧化酶基因对谷氨酸进行脱氨反应，将其转化为α-酮戊二酸，生成的游离NH3和H2O2则可以中和胞内多余的质子从而提高菌体的耐酸能力，所述耐酸系统能够有效应用到生物产品的发酵生产中，该系统不会产生对菌体具有抑制作用的γ-氨基丁酸或胍丁胺，不需要表达γ-氨基丁酸或胍丁胺转运蛋白的基因，减少了重组菌株的负担；反应中生成的α-酮戊二酸可以直接进入TCA循环，为菌体生长提供能量，有效减少液氨的用量，并且有效避免了pH波动对发酵造成的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种耐酸性苏氨酸生产菌及其构建方法与应用。

背景技术

目前大肠杆菌具有三种已知的耐酸系统(ARs)。AR₁系统(一般也称为氧化系统)的机制仍然没有弄清楚，但可以确定的是它需要激活编码σSandCRP(cAMP的受体蛋白)的基因，并且被葡萄糖抑制。AR₂系统中包含谷氨酸(Glu)/γ-氨基丁酸(GABA)转运蛋白GadC和两个谷氨酸脱羧酶GadA和GadB。氨基酸转运蛋白GadC可以转换胞外Glu进入细胞内，与胞内的质子结合并在谷氨酸脱羧酶的作用下形成GABA，GABA再在GadC的作用下运输到胞外。类似AR₂系统，AR₃系统也由两部分组成，L-精氨酸(Arg)/胍丁胺(Agmatine)转运蛋白AdiC和精氨酸脱羧酶AdiA。精氨酸通过AdiC进入胞内，与质子结合并在AdiA作用下形成Agmatine，Agmatine再由AdiC运输到胞外。ARs系统在酸性条件下被激活，通过转移胞内质子增加pH值，提高大肠杆菌在酸性环境的生存能力。

在ARs系统的启发下，清华大学的研究人员构建了一个新型大肠杆菌耐酸性系统，通过表达氨基酸逆向转运蛋白GadC，酸性激活的谷氨酰胺酶YbaS将谷氨酰胺转化为谷氨酸盐同时释放游离NH₃，再结合AR₂系统提高大肠杆菌的耐酸能力。这种YbaS和GadC可被酸性pH激活，且只在pH6.0以下时才能适当发挥功能。

然而，现有的报道只是对大肠杆菌耐酸机制进行研究，并没有将其应用于生物产品的发酵生产中。同时通过AR₂或AR₃系统会产生对细胞具有抑制作用的γ-氨基丁酸或胍丁胺，而且γ-氨基丁酸或胍丁胺排出到胞外也会影响到目的产物的分离提取。因此，依赖于AR₂或AR₃系统的耐酸性大肠杆菌无法真正应用于工业化规模的生产中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法所获得的耐酸性苏氨酸生产菌。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，用于制备苏氨酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，以苏氨酸生产菌E.coliTHRD(保藏号CGMCCNo.11074)为研究对象，通过分子改造，在pTrc99A质粒上过表达合成谷氨酸氧化酶基因，或者整合合成谷氨酸氧化酶基因到E.coliTHRD基因组，得到耐酸性苏氨酸生产菌株。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)合成谷氨酸氧化酶(LGOX)基因片段；

(2)将谷氨酸氧化酶(LGOX)基因及其表达载体pTrc99A用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切后连接，连接产物转化至E.coliTHRD中；或者

利用Red同源重组基因敲除方法，整合LGOX基因到E.coliTHRD的阿拉伯糖基因araABD位点上；

其中，所述谷氨酸氧化酶LGOX的核苷酸序列为序列表<400>1所示序列，所述阿拉伯糖基因araABD的核苷酸序列为序列表<400>2所示序列，

所得表达谷氨酸氧化酶的基因工程菌即为耐酸性苏氨酸生产菌。

由上述耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法所获得的耐酸性苏氨酸生产菌，是在pTrc99A质粒上过表达谷氨酸氧化酶基因或者整合谷氨酸氧化酶基因到E.coliTHRD基因组阿拉伯糖位点的耐酸性生产菌株。

上述耐酸性苏氨酸生产菌在制备苏氨酸方面的应用。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，制备苏氨酸的具体步骤如下：

(1)摇瓶发酵：①种子培养：将所述耐酸性苏氨酸生产菌从活化斜面上挑取2环接种于装有30-50mL种子培养基的500mL圆底三角瓶中9层纱布封口，置于旋转式摇床上，32-37℃，100-250rpm振荡培养6-10h；②摇瓶发酵：按5-10％接种量将步骤①中的种子培养物接入装有30-50mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中；以溴甲酚紫为指示剂在pH5.2，以溴百里酚蓝为指示剂在pH6.0条件下进行摇瓶发酵，发酵温度32-37℃，转速100-250rpm，发酵周期26-30h；

(2)发酵罐发酵：①种子培养：将8-10mL无菌水加入到3支活化斜面中制备菌悬液，将所有菌悬液接入装有1.5L种子培养基的5L发酵罐中，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-50％，通风量3-5m³/h，搅拌转速200-600rpm，35-37℃培养6-8h；②发酵罐发酵培养：以10％-13％接种量将步骤①中的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35-37℃，通风量3-5m³/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-60％，流加浓度为60-80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)；发酵前期流加25％(W/V)的氨水控制发酵液pH至6.8-7.2，发酵中后期流加25％(W/V)的氨水控制发酵液pH至5.8-6.2，发酵周期26-28h。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，所述活化斜面所使用的培养基为：葡萄糖0.5-1g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏2.5-5g/L，酵母粉2.5-5g/L，NaCl1-2.5g/L，琼脂条10-20g/L。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，所述步骤(1)、(2)中种子培养基成分为：葡萄糖15-25g/L，酵母粉5-10g/L，胰蛋白胨3-6g/L，(NH4)₂SO₄1-2g/L，KH₂PO₄0.6-1.2g/L，MgSO4·7H₂O0.3-0.5g/L，FeSO₄·7H₂O5-10mg/L，MnSO₄·H₂O5-10mg/L，B族维生素(VB₁、VB₃、VB₅、VB₇、VB₁₂)0.5-1mg/L，VH0.15-0.3mg/L。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，所述步骤(1)、(2)中发酵培养基成分为：葡萄糖25-40g/L，酵母粉1-2g/L，胰蛋白胨2-4g/L，柠檬酸钠0.5-1g/L，谷氨酸3-5g/L，KH₂PO₄1-2g/L，MgSO₄·7H₂O0.4-0.7g/L，FeSO₄·7H₂O30-50mg/L，MnSO₄·H₂O30-50mg/L，B族维生素(VB₁、VB₃、VB₅、VB₇、VB₁₂)0.6-0.8mg/L，VH0.1-0.2mg/L，摇瓶中发酵培养基用稀硫酸调节初始pH值至5.2或6.0，发酵罐中发酵培养基初始pH值7.0,115℃灭菌20min。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，所得发酵液中苏氨酸的检测方法如下：

①发酵液预处理：取1mL发酵液于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜；

②衍生方法：取过膜后发酵液10μL于2mL离心管中，加入200μL，4.2g/L的NaHCO₃溶液，混匀后加入200μL，含有1％的2，4-二硝基氟苯(DNFB)的乙腈溶液混匀，将离心管置于60℃水浴箱中暗处恒温水浴1h，取出冷却至室温后，加入6.8g/L的KH₂PO₄溶液定容至1.3mL，混匀进样；

③高效液相色谱检测：色谱柱为AgilentZORBAXEclipseAAA，流动相为乙酸钠-乙腈梯度洗脱，见表a，流速1.0mL/min，柱温33℃，检测波长360nm。

表a洗脱梯度曲线

本发明的有益效果是：

上述耐酸性苏氨酸生产菌通过在苏氨酸生产菌E.coliTHRD中表达谷氨酸氧化酶基因LGOX，将L-谷氨酸氧化为α-酮戊二酸，同时生成游离NH₃和H₂O₂；α-酮戊二酸可以继续参与TCA循环为菌体生长提供能量，NH₃和H₂O₂则可以中和胞内多余的质子从而提高菌体的耐酸能力；上述改造得到的耐酸性大肠杆菌可以有效的应用到苏氨酸的发酵生产中；

本发明通过设计了一种新颖的耐酸系统用于制备苏氨酸，利用谷氨酸氧化酶基因对谷氨酸进行脱氨反应，将其转化为α-酮戊二酸，生成的游离NH₃和H₂O₂则可以中和胞内多余的质子从而提高菌体的耐酸能力，所述耐酸系统能够有效应用到生物产品的发酵生产中。

与传统的耐酸系统相比，该系统不会产生对菌体具有抑制作用的γ-氨基丁酸或胍丁胺，不需要表达γ-氨基丁酸或胍丁胺转运蛋白的基因，减少了重组菌株的负担；反应中生成的α-酮戊二酸可以直接进入TCA循环，为菌体生长提供能量，因此不会对目的产物的分离提取造成影响；利用耐酸性大肠杆菌发酵生产苏氨酸，可以有效减少液氨的用量，并且有效避免了pH波动对发酵造成的影响，适用于工业化应用。

附图说明

图1为质粒pTrc99A-LGOX的双酶切验证图，其中，M：Marker1：HindⅢ和BamHⅠ双酶切pTrc99A-LGOX；

图2为外源基因LGOX的整合图。

保藏信息

分类名词：大肠埃希氏菌Escherichiacoli

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年7月14日

保藏号：CGMCCNo.11074

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

耐酸性苏氨酸生产菌株E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX的构建方法。

(1)合成谷氨酸氧化酶LGOX基因片段；

(2)以合成的pET-His-LGOX质粒为模板，经限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ分别双酶切回收谷氨酸氧化酶LGOX片段；采用T4连接酶连接至相同酶切的表达载体pTrc99A，采用CaCl₂法将其转化至E.coliDH5α感受态中，涂布于含100ug/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h；挑取单菌落转接含有LB培养基的15mL试管中，37℃培养12h后提取获得重组质粒pTrc99A-LGOX；

(3)采用CaCl₂法将重组质粒pTrc99A-LGOX转入苏氨酸生产菌E.coliTHRD(保藏号CGMCCNo.11074)感受态中，涂布于含100ug/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h；挑取生长出的菌落进行菌落PCR验证，将鉴定为阳性的转化子接入LB液体培养基，37℃培养12h后提取质粒进行酶切验证；验证结果如图1所示，表明重组质粒pTrc99A-LGOX已成功转入E.coliTHRD中，得到耐酸性苏氨酸生产菌E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX。

实施例2

耐酸性苏氨酸生产菌株E.coliTHRDaraABD::LGOX的构建方法。

(1)合成谷氨酸氧化酶LGOX基因片段；

(2)采用PCR技术以THRD基因组为模板扩增阿拉伯糖启动子pBAD作为上游同源臂，以及扩增阿拉伯糖基因位点下游作为下游同源臂；

(3)采用PCR技术扩增pKD3上的氯霉素抗性片段；

(4)根据基因序列设计同源臂引物，以步骤(1)(2)(3)获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得整合片段，所述整合片段由pBAD上游同源臂、LGOX基因片段、氯霉素抗性基因片段、下游同源臂组成，如图2所示；

(5)将整合片段电转化至含有pKD46质粒的E.coliTHRD中获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得阿拉伯糖基因araABD替换为LGOX基因的耐酸性苏氨酸生产菌E.coliTHRDaraABD::LGOX。

阿拉伯糖启动子pBAD的核苷酸序列为序列表<400>3所示序列。

氯霉素抗性基因片段的核苷酸序列为序列表<400>4所示序列，同源臂下游片段的核苷酸序列为序列表<400>5所示序列。

实施例3

耐酸性苏氨酸生产菌株E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX的摇瓶发酵培养及检测

(1)种子培养：将E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX和E.coliTHRD从活化斜面上挑取2环接种于装有30mL种子培养基的500mL圆底三角瓶中9层纱布封口，置于旋转式摇床上，36℃，200rpm振荡培养8h；

活化斜面所使用的培养基为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂条20g/L；

种子培养基成分为：葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，胰蛋白胨6g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO41.2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，MnSO4·H2O10mg/L，B族维生素(VB1、VB3、VB5、VB7、VB12)1mg/L，VH0.3mg/L；

(2)摇瓶发酵：按10％接种量将步骤(1)中的种子培养物接入装有30mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中。以溴甲酚紫为指示剂在pH5.2，以溴百里酚蓝为指示剂在pH6.0条件下进行摇瓶发酵，发酵温度37℃，转速200rpm，发酵周期28h。

发酵培养基成分为：葡萄糖40g/L，酵母粉2g/L，胰蛋白胨4g/L，柠檬酸钠1g/L，谷氨酸5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，FeSO4·7H2O50mg/L，MnSO4·H2O50mg/L，B族维生素(VB1、VB3、VB5、VB7、VB12)0.8mg/L，VH0.2mg/L，用稀硫酸调节初始pH值至5.2或6.0。

(3)发酵结果检测：①发酵液预处理：取1mL发酵液于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜。②衍生方法：取过膜后发酵液10μL于2mL离心管中，加入200μL，4.2g/L的NaHCO₃溶液，混匀后加入200μL，含有1％的2，4-二硝基氟苯(DNFB)的乙腈溶液混匀，将离心管置于60℃水浴箱中暗处恒温水浴1h，取出冷却至室温后，加入6.8g/L的KH₂PO₄溶液定容至1.3mL，混匀进样。③高效液相色谱检测：色谱柱为AgilentZORBAXEclipseAAA，流动相为乙酸钠-乙腈梯度洗脱，见表1，流速1.0mL/min，柱温33℃，检测波长360nm。检测结果见表2。

摇瓶实验结果证明谷氨酸氧化酶基因的导入有助于提高发酵菌株在酸性pH条件下的生产能力。pH5.2条件下，E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX菌体干重和苏氨酸产量分别为原菌的1.58和1.64倍；pH6.0条件下E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX菌体干重和苏氨酸产量分别为原菌的1.65和1.67倍。

表1洗脱梯度曲线

表2摇瓶发酵结果

实施例4

耐酸性苏氨酸生产菌株E.coliTHRD-pTrc99A-LGOX和E.coliTHRDaraABD::LGOX的上罐发酵培养及检测

(1)种子培养：将10mL无菌水加入到3支活化斜面中制备菌悬液，将所有菌悬液接入装有1.5L种子培养基的5L发酵罐中，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.0，溶氧维持在30％，通风量4m³/h，搅拌转速400rpm，36℃培养8h。

活化斜面培养基及种子培养基同实施例3。

(2)发酵罐发酵培养：以11％接种量将步骤(1)中的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度37℃，通风量5m³/h，搅拌转速600rpm，溶氧维持在40％，流加浓度为70％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.3％(W/V)。发酵前期流加25％(W/V)的氨水控制发酵液pH至7.0，发酵中后期流加25％(W/V)的氨水控制发酵液pH至6.0，发酵周期28h。

发酵培养基成分为：葡萄糖40g/L，酵母粉2g/L，胰蛋白胨4g/L，柠檬酸钠1g/L，谷氨酸5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，FeSO4·7H2O50mg/L，MnSO4·H2O50mg/L，B族维生素(VB1、VB3、VB5、VB7、VB12)0.8mg/L，VH0.2mg/L。

(3)发酵结果检测：检测方法同实施例3。检测结果见表3。

表3上罐发酵结果

上罐结果表明，表达谷氨酸氧化酶的基因工程菌在pH6.0的条件下能够更有效的积累苏氨酸，基因工程菌与原菌的菌体干重基本一致，但E.coliTHRD-pTrc99A-LGOXL-苏氨酸产量和菌体糖酸转化率较原菌分别提高了10.00％和10.91％；E.coliTHRDaraABD::LGOXL-苏氨酸产量和菌体糖酸转化率较原菌分别提高了分别提高了6.00％和5.60％。

上述参照具体实施方式对该一种苏氨酸生产菌及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。