一个水稻矮杆窄叶突变基因的定位及早衰和雄性不育基因SMS1的功能分析

摘要

常规粳稻秀水09经过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理，获得了一个矮秆窄叶突变体dnl1（(d)warf and(n)arrow(l)eaf1）。本文对dnl1突变体进行了相关表型分析、突变性状的遗传分析和基因定位，并从组织细胞学的角度初步解释了dnl1突变体矮秆窄叶形成的原因。主要结论如下:
　　1.dnl1突变体与野生型秀水09杂交，F1表现出与秀水09相同表型。F2出现矮秆窄叶与高秆宽叶两种表型，经卡平方检验表明符合1∶3，推定突变性状由一对隐性基因控制。
　　2.dnl1突变体与野生型比较，自播种两周左右苗高开始出现明显差异，dnl1突变体比野生型早开始分蘖且分蘖数明显多于野生型。突变体的株高只有野生型的55.69％，而突变体的分蘖数则是野生型的2.19倍。突变体的穗和茎秆各节间平均长度与野生型对应部分对比变化显著。野生型上三叶平均宽度均是突变体的2倍以上，平均长度是突变体的1.6倍以上。
　　3.通过图位克隆的方法将DNL1基因定位到水稻4号染色体，经鉴定发现DNL1是NAL1的一个等位基因。在DNL1基因8552bp处发生了G突变为A的单碱基突变，从而导致对应编码的氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。
　　4.石蜡切片结果显示，dnl1突变体叶肉细胞较野生型秀水09小。dnl1突变体叶片横切切片展示出比同时期的野生型叶片厚，两个维管束间的间距小。茎秆纵切切片显示，dnl1突变体茎秆细胞比秀水09要窄而短，茎秆细小且薄。这些特征在组织细胞学上解释了dnl1突变体在整体上比野生型矮化，叶片变窄变短的原因。
　　植物的衰老是植物生长发育过程中许多内外因素综合作用的结果。研究植物衰老的诱发因素和调节机制对延缓植物的衰老有重要意义。对农作物来说，延缓衰老能有效提高作物的产量，从而产生巨大的经济效益。细胞程序性死亡(PCD)是植物衰老的一种表征，也是诱发植物衰老的重要因素之一。雄性不育是一种广泛存在于开花植物中的现象，它在育种中有着重要的作用。雄性不育系的应用不仅提高了杂交育种的效率，而且大幅提高了水稻的产量和品质。杂交水稻生产体系的核心是雄性不育材料的发掘和利用。本论文对一个导致水稻早衰和雄性不育的基因SMS1进行了初步分析，主要结论如下:
　　1.生物信息学分析显示SMS1基因编码一个UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)，它催化葡萄糖-1-磷酸和UTP与UDP-葡萄糖和焦磷酸之间的转化。
　　2.应用水稻原生质体系统，将水稻SMS1 CDS融合YFP报告基因的pA7-SMS1-YFP双元表达载体在水稻原生质体中表达。荧光共聚焦显微镜下，在细胞膜、细胞质、细胞核均能观察到激发荧光，由此推断SMS1基因在水稻细胞中是遍在表达的。
　　3.成功构建SMS1 Promoter驱动GUS报告基因的p1300-SMS1 Pro-GUS载体和Ubi Promoter驱动的pUN1301-SMS1-OE过表达载体，通过农杆菌转化日本晴愈伤组织获得转基因阳性株系。GUS染色显示，SMS1在叶片、叶鞘、节、节间、颖壳等组织有表达，在叶鞘和节表达较强，而在叶尖和颖壳表达较弱。RealTime-PCR结果显示，实验所取过表达转基因阳性株系较正常日本晴均有过表达，表达量最高的接近正常日本晴表达水平的300倍。
　　4.对sms1突变体叶片不同部位和野生型叶片进行超薄切片观察，结果显示sms1突变体细胞出现空腔，细胞核膨大，表现出PCD的特征，而野生型细胞内叶绿体等内容物丰富。sms1突变体的细胞壁疏松，棱廓模糊，部分细胞壁较薄，而野生型细胞壁比较致密且棱廓清晰。由此推测sms1突变体缺失编码UGPase的SMS1基因，导致细胞壁合成障碍，因此诱发了水稻的PCD过程，从而出现早衰表型。

目录

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 水稻矮秆窄叶性状研究进展

1．2 细胞程序性死亡与UGPase基因的研究

1．2．1 细胞程序性死亡(PCD)

1．2．2 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)

第2章 一个水稻矮秆窄叶突变基因的定位

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 突变性状的遗传分析

2．2．2 表型分析和统计

2．2．3 突变基因DNL1的定位

2．2．4 组织切片分析

2．3 讨论

第3章 水稻SMS1基因的功能分析

3．1 背景介绍

3．2 材料和方法

3．2．1 细菌菌种和载体

3．2．2 药品和试剂

3．2．3 表型分析

3．2．4 水稻SMS1-YFP融合蛋白的亚细胞定位

3．2．5 SMS1组织定位和过表达

3．2．6 水稻转基因

3．2．7 转基因植株的鉴定和分析

3．2．8 超薄切片

3．3 结果与分析

3．3．1 表型分析

3．3．2 载体的构建和验证

3．3．3 SMS1的亚细胞定位

3．3．4 水稻转基因

3．3．5 SMS1的组织表达模式

3．3．6 SMS1过表达的检测

3．3．7 超薄切片分析

3．4 讨论

参考文献

附录A 本研究中常用实验操作方法

附录B 本研究中常用试剂的配制方法

附录C 本研究中常用培养基的配制方法

附录D 本研究中生物信息学分析网址

致谢

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