半夏软腐病的病原菌鉴定及其生物防治初探

摘要

半夏(Pinellia ternata(Thunb．)．Breit．)为天南星科半夏属植物，是我国中药宝库中的大宗药材，已收入《中国药典》。半夏还是一种主要的出口创汇药材，目前国内外两个市场的年需求量为5,500吨～6,000吨，较20世纪90年代增长了50﹪以上。然而，多年来由于过度采集及环境的破坏，野生半夏资源已近枯竭，半夏原料供不应求，半夏伪品充斥市场，造成半夏用药的严重混乱和安全隐患。为解决供需矛盾和保护野生资源，我国从20世纪70年代开始半夏野生变家种及其栽培技术研究。在半夏规模化种植中，不少技术瓶颈如品质衰退、病害发生严重，增加了半夏栽培风险，其中软腐病的危害最为严重。为此，我们对半夏软腐病的病原及其发生情况进行了研究。 2005年对几个半夏主产地(山西、甘肃、山东、四川、浙江、安徽和江苏等)的主要种植基地进行了软腐病原的调查。对这些基地随机采集的半夏球茎进行细菌分离和致病性试验，结果从山西、甘肃、山东、四川、浙江、安徽、江苏和河南等地的半夏样品中分别获得52、63、57、69、55、66、51和53个分离物，其中同一地方的样品中有2-3种菌的分离频率较高。烟草过敏性试验表明，山西、甘肃、山东、四川、浙江、安徽、江苏和河南等地的分离物中分别有12、3、6、2、6、6、5和3个分离物可引起烟草产生过敏性反应；其中可引起半夏组织软腐的分离物分别有9、3、6、2、6、4，4和3个。可见，各种植基地的半夏样品均带有软腐病原菌。山西，甘肃，山东，四川，浙江，安徽，江苏和河南各种植基地半夏球茎的带病率分别为36﹪、12﹪、24﹪、8﹪、24﹪、16﹪、16﹪和12﹪。2006年从带病率较高的浙江、山西和山东种植基地采集发病样品进行病原菌的分离与鉴定。结果从浙江、山西和山东样品中分别获得8、12和13种细菌分离物。致病性试验表明，分离物SXR1、SXR2、SXR4、ZJR1、ZJR3、ZJR4、ZJR9、SDR1、SDR2、SDR5、SDR10使烟草叶片发生过敏性反应。其中，分离物ZJRl、SXRl和SDR1可使半夏球茎切片发生软腐，并伴随恶臭，发病率为100﹪。它们也可引起半夏植株发生与田间相似的软腐症状，主要表现为：植株出现水渍状坏死、倒伏、软化和腐烂，并伴随恶臭；球茎发生水渍状坏死、腐烂，最后只留下表皮空壳；根部出现半透明、软化和腐烂。无论是半夏组织还是植株，分离物ZJRl和SXRl引起的发病过程较快，SDRl发病则相对较慢。可见分离物ZJR、SXR和SDR1是引发浙江、山西和山东半夏软腐的病原菌。这3个病原菌对胡萝卜、萝卜，土豆，青椒、番茄、黄瓜、掌叶半夏和芋头也有浸染性，引起软腐病害，但对洋葱和生姜没有浸染性。应用传统方法和分子生物学方法对病原菌ZJR1、SXR1和SDR1进行了鉴定。从形态上，病原菌ZJR1、SXR1和SDR1与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种一致：菌落光滑、边缘整齐、稍凸起、半透明、有光泽，没有色素产生；革兰氏阴性杆菌，周生鞭毛。生理生化特征方面，3个病原菌与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种基本相似，除了3个病原菌的最高生长温度(39℃)高于己报道的胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种菌株，以及对几种碳源的利用情况不同。BIOLOG系统鉴定结果表明，病原菌ZJR1和SXR1对95种碳源的利用情况相同；病原菌ZJR1、SXR1和SDR1与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种最相似，相似性分别为61.6﹪、63.5﹪和66.9﹪；但它们与该亚种的部分碳源利用情况有所不同，表明它们既相关又相区别。脂肪酸成分分析(MIDI鉴定系统)也表明，3个病原菌与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种的相似性最大，分别为72.9﹪、78.2﹪和77.9﹪，但它们的主要脂肪酸比值却与之不同。16S rRNA基因序列同源性分析表明，病原菌ZJRl和SXRl与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种的同源性最大，但仅为97.6﹪，不在一个种的界定范围。邻近法(NJ)、最大相似法(MP)和最大简约法(ML)所构建16S rDNA序列的系统发育树，也表明这2个病原菌与胡萝卜果胶杆菌亲缘关系相近，其中与P．carotovorum subsp．carotovorum 和 P．carotovorum．subsp．odriferum亚种最近，但自成一簇。PCR-RFLP鉴定结果表明病原菌ZJR1和SXR1与P． carotovorum subsp．odriferum不相关，而与P．carotovorum subsp．carotovorum相关。以上生理生化和分子生物学鉴定结果均表明，病原菌ZJR1、SXR1和SDR1与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种高度相关，但又与之区别，我们推测这些病原菌是胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种的变种。 为探索半夏软腐病的生物防治途径，研究了几种抗生素对病原菌ZJR1、SXR1和SDR1的拮抗效果，同时进行了拮抗内生菌的分离和筛选。结果，氨苄青霉素和井岗霉素对3个病原菌的拮抗效果最强，青霉素和链霉素次之，这为选用抗生素防治提供了一些依据。从各地半夏球茎中分离出12株有一定拮抗效果的内生菌，其中2株内生菌的拮抗效果较强，初步显示了内生菌在半夏软腐病生物防治中的潜在作用。显然，为获得对高效拮抗内生菌，应进行广泛的筛选和深入研究。

目录

文摘

英文文摘

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第一章 文献综述

1.1半夏概述

1.1.1半夏资源分布

1.1.2半夏的生物学特性

1.1.3半夏的人工栽培现状

1.2半夏的主要病害及防治

1.2.1软腐病

1.2.2病毒病

1.2.3叶斑病

1.2.4基腐病

1.3软腐病相关研究进展

1.3.1分类

1.3.2寄主与分布

1.3.3致病机理

1.4研究目的

1.5研究内容

第二章 半夏软腐病原菌的分离与致病性试验

2.1材料与方法

2.1.1样品采集

2.1.2病原菌的分离

2.1.3致病性测定

2.2结果与分析

2.2.1病原菌的调查

2.2.2病原菌的分离与致病性试验

2.3小结与讨论

第三章 病原菌的鉴定

3.1材料与方法

3.1.1菌株

3.1.2形态观察

3.1.3常规生理生化鉴定

3.1.4 Biolog鉴定

3.1.5甲基脂肪酸的气相色谱分析

3.1.6 G+C含量检测

3.1.7 RFLP-PCR分析

3.1.8 16S rRNA基因序列分析

3.2结果与分析

3.2.1形态特征

3.2.2菌株的生理生化特征

3.2.3 Biolog分析

3.2.4脂肪酸成分分析

3.2.5 DNA的G+C含量

3.2.6 PCR-RFLP

3.2.7 16S rRNA序列分析

3.3讨论

第四章 半夏软腐病的生物防治初探

4.1材料与方法

4.1.1半夏病原菌

4.1.2抗生素纸片

4.1.3半夏样品

4.1.4菌液的制备

4.1.5药敏性试验

4.1.6拮抗内生菌的筛选

4.2结果与分析

4.2.1药敏性试验

4.2.2拮抗菌筛选

4.3小结与讨论

总结

参考文献

致谢

附录1 重要溶液的配置

附录2 在读硕士期间发表的论文