家蚕中一个新的膜蛋白BmMP160基因的克隆、表达以及在5龄蚕组织中分布

摘要

在对家蚕蛹期cDNA文库测序中，我们筛选到一条cDNA序列，通过生物信息学分析，推测可能是家蚕-膜蛋白基因。该基因长度为726bp，由3个外显子和2个内含子构成，ORF长483bp，编码160个氨基酸残基，蛋白分子量18.58kD，因此我们将其命名BmMP160(Bombyxmorimembraneprotein160)，GenBank登录号为DY231129。将BmMP160与数据库中的蛋白进行比对，发现该蛋白仅与昆虫中的一些假想蛋白具有很高的同源性，而在其他种属中同源性不高。 通过PCR把BmMP160的ORF扩增后插入到载体pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点，获得重组表达质粒pET-28a(+)-BmMP160，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析，在22kD处有一浓集特异性蛋白条带，与预期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵体的形式存在，超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤；对包涵体进行溶解和梯度透析复性；采用亲和层析纯化融合蛋白rBmMP160。以该融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，制备了BmMP160多克隆抗体，经ProteinAHP凝胶柱纯化后，ELISA检测该抗体的效价可达到1:8000。免疫印迹检测显示该抗体对BmMP160有特异性识别能力。免疫印迹检测结果还表明，BmMP160在家蚕五龄幼虫的头部、表皮、肠、丝腺、脂肪体、气门、马氏管和生殖腺中均有表达。亚细胞定位和TIRF结果表明，BmMP160定位于细胞质膜上。

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英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章膜蛋白综述

1生物膜

2膜蛋白

2.1膜蛋白的分类

2.2膜蛋白的功能

2.3膜蛋白的结晶

2.4膜蛋白的预测

第二章实验设计方案

1研究目的和意义

2实验内容

3实验流程图

第三章生物信息学分析

1工具和软件

2方法

3结果

3.1 BmMP160基因的序列

3.2 BmMP160蛋白序列多重比对

3.3 BmMP160蛋白跨膜区预测

3.4 BmMP160蛋白疏水性分析

3.5 BmMP160蛋白信号肽分析

3.6 BmMP160蛋白功能位点分析

4讨论

第四章家蚕BmMP160基因的克隆与原核表达

1材料与试剂

1.1材料

1.2试剂

1.3试剂的配制

2方法

2.1PCR扩增目的片段

2.2PCR产物的纯化

2.3质粒的小量制备

2.4双酶切目的片段与表达载体pET-28a(+)并回收

2.5连接反应

2.6 E.coli TG1、BL21(DE3)感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.7连接产物的转化

2.8重组pET-28a(+)-BmMP160质粒的筛选与鉴定

2.9重组质粒的转化及鉴定

2.10重组质粒在大肠杆菌中表达

2.11SDS-PAGE电泳分析

3结果

3.1PCR扩增目的片段

3.2重组质粒的PCR扩增和双酶切鉴定

3.3序列测定

3.4重组蛋白的诱导表达

4讨论

第五章重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备

1材料与试剂

1.1材料

1.2试剂

1.3试剂的配制

2方法

2.1包涵体的溶解与复性

2.2镍柱亲和层析

2.3Bradford检测蛋白浓度

2.4抗体制备

2.5 Western blotting检测抗体特异性

3结果

3.1重组蛋白的纯化结果

3.2抗体的纯化

3.3抗体的效价测定

3.4 Western blotting检测抗体特异性

4讨论

第六章BmMP160在家蚕幼虫中的组织分布

1材料与试剂

1.1材料

1.2试剂

1.3试剂的配制

2方法

2.1蛋白质的抽提

2.2 Western blotting检测BmMP160蛋白的组织分布

3结果

4讨论

第七章亚细胞定位

1材料与试剂

1.1材料

1.2试剂

1.3试剂配制

2方法

3结果

4讨论

结论

参考文献

致谢

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