一点红萝卜中未知dsRNA6的序列及功能分析

摘要

于杭州市郊采集一点红萝卜植株，提取叶片组织中的dsRNA，获得2条大小在1700-2000bp范围之内的dsRNA条带。此结果与我们以前报道的结果类似。采用SPAT和RT-PCR方法获得上述dsRNA条带的cDNA。克隆测序的结果显示两条较大的dsRNA条带长度分别为1866bp和1791bp，且核酸序列与我们以前报道的RasR1和RasR2完全相同。与此同时我们还得到一条新的序列，全长1778bp，将其命名为RasR6。 RasR6正链中含有一个ORF，编码的蛋白质含有502个氨基酸，分子量约为55.1kDa。在GenBank数据库中通过BLAST-P程序搜寻序列与之相似的蛋白并以此推测RasR6的功能。结果显示有5条蛋白序列与RasR6编码的蛋白具有同源性，且这5条序列均编码Partitiviridae成员的CP(coatprotein)。根据以上分析我们推测RasR6的功能是编码萝卜某一病毒的CP。 RasR6中A、G、T和C的含量分别为24.63％、18.11％、26.43％和30.82％，很明显G的含量比其它三种碱基的含量低，这种现象在已报道的Partitiviridae成员中普遍存在。RasR6与RasR.1的5’UTR长度分别为79bp和70bp，二者同源性为65.4％，共同拥有4个保守区域，包括末端的5’AGAAAAA笔TTT3’。RasR6的3’UTR(190bp)明显长于RasR1的3’UTR(74bp)，它们之间的同源性为25.7％，但两者也有一些保守区域，包括3’末端的5’AAAATAAAA3’。RasR6序列两端的UTR分别与相应RasR2序列两端的UTR有较高的同源性。RasR6与RasR2的5’UTR长度相当，分别为79bp和77bp，同源性高达82.3％，二者具有3个较长的保守区域，包括末端的5’AGAAAAATTTTAGA3’；RasR6与RasR2的3’UTR长度也相当，分别为190bp和196bp，二者同源性为66.0％，并且同时具有多个保守区域，包括3’末端的5’TAAAAAAAA3’。此外，RasR2和RasR6的全长序列也拥有多个保守区域，二者同源性为54％。但是，核苷酸序列比对结果同时也显示：RasR6与来源于萝卜的RasR3，RasR4和RasR5的UTR则没有明显的相似性。 根据RasR1，RasR2和RasR6共存于同一株萝卜的事实(克隆和杂交实验结果均证实这一结论)以及它们之间UTR比对的信息，我们推测这三条dsRNA同属于已经报道的Raphanussativusvirus1(RasV1)。由于RasR6与5个Partitiviridae成员的CP具有一定的相似性，据此推测RasR6与RasR2共同编码该病毒的CP，但同时也不排除它作为satelliteRNA存在的可能性。 关于RasR6也编码RasV1的CP与目前对Partitiviridae成员的描述不一致，如果RasR6编码CP，那么RasR6与RasR2二者之间是如何相互作用的?为什么Raphanussativuscrypticvirus1中含有两种不同的CP?以上问题都有待于深入研究。因此，本研究的结果为正确定义该科病毒特征奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：略语表

声明

第一章文献综述

1.1 dsRNA病毒

1.2双分病毒科病毒

1.2.1双分病毒科病毒概述

1.2.2双分病毒科病毒的研究意义与进展

1.3萝卜中的dsRNA病毒

1.3.1国外关于萝卜dsRNA病毒的研究进展

1.3.2国内关于萝卜dsRNA病毒的研究进展

1.4研究内容及目的

1.4.1研究内容

1.4.2研究目的

第二章 萝卜中未知dsRNA 6的克隆

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2酶与试剂

2.1.3用于SPAT的接头

2.1.4萝卜叶片组织dsRNA的大量提取

2.1.5病毒基因组dsRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1.6 5%PAGE凝胶电泳条带的透析袋同收

2.1.7 M-SPAT方法获得目的dsRNA条带的cDNA

2.1.8 DNA凝胶同收试剂盒回收PCR产物

2.1.9 DNA片段的连接反应

2.1.10 CaCl2法制备感受态细胞

2.1.11重组质粒的转化

2.1.12碱法抽提重组质粒

2.1.13重组质粒的PCR鉴定

2.1.14重组质粒的酶切鉴定

2.1.15重组质粒插入片段的测序与数据分析

2.2结果与分析

2.2.1田间样品dsRNA的抽提结果

2.2.2 dsRNA 1和dsRNA 2 cDNA的获得

2.2.3序列的测定

2.2.4序列的分析

2.3小结与讨论

第三章RasR 6的来源与归属分析

3.1材料与方法

3.1.1实验材料的采集与保存

3.1.2主要试剂

3.1.3引物的设计

3.1.4 total RNA的提取

3.1.5病毒基因组dsRNA的大量提取

3.1.6以total RNA为模板分段克隆RasR 6

3.1.7田间样品的斑点杂交检测

3.2结果与分析

3.2.1 total RNA的抽提与RT-PCR结果

3.2.2重组质粒的抽提和PCR鉴定结果

3.2.3 fragment 1～fragment 3的测序结果

3.2.4探针模板的制备

3.2.5田间样品的斑点杂交检测结果

3.3小结与讨论

总讨论

参考文献

附图

附表

致谢

附件