一点红萝卜中dsRNA病毒的研究

摘要

双分病毒科病毒为双链RNA(dsRNA)病毒，包括双分病毒属，α-隐潜病毒属和β-隐潜病毒属，侵染植物和真菌，但对寄主不产生明显影响。双分病毒科内属的划分主要以病毒粒子形态、寄主范围、基因组dsRNA的大小以及血清学关系等为依据。随着病毒基因序列的大量测定，亟需把病毒基因组及蛋白的分子特征，以及病毒之间的进化关系作为双分病毒的分类依据。以病毒RdRp序列比对为基础，对双分病毒科成员进行的系统发生分析，结果表明，此科病毒聚类成两个大组--组A和组B，且每组包含两个亚组，分别为亚组I、II和亚组III、IV。每个大组均含有一个侵染植物的亚组和一个侵染真菌的亚组。病毒成员基因组，诸如碱基组成，功能蛋白的大小和核酸序列功能区域的保守性(5’末端非编码区)等分子特征，也支持此系统发生分析结果。据此，我们提议把双分病毒科划分为四个属：α-隐潜病毒属和β-隐潜病毒属，分别对应于亚组II和亚组III，它们的寄主主要为植物；α-双分病毒属和β-双分病毒属，分别对应于亚组I和亚组IV，主要寄主为真菌。
　　 之前，我们在一点红萝卜(Raphanu.sativu.cv.Yidianhong)中分离到了两种种传的三分体的双分病毒。改进病毒检测方法、扩大检测范围后，又发现了三种具有类似传播特性的病毒。分析结果显示，一点红萝卜和圆白萝卜中的dsRNA主要分为三种类型，初步推测它们分别是三种侵染萝卜的病毒：1)一点红中大小约为150.bp左右的单.dsRNA，暂定名为RasV.ds.(Raphanu.sativusvirus.dsRNA):2)大小约为350.bp的两条大小相近的dsRNA，暂命名为RasV.ds.(Raphanu.sativu.viru dsRNA)；3)存在于圆白萝卜中的大小约为150.bp的两条大小相近的dsRNA，暂定名为RasV.ds.(Raphanu.sativu.virus.dsRNA)，RasV.dsR大小在这两条dsRNA之间。提取病毒粒子后，电镜观察显示：RasV3为直径约3.nm的球状病毒粒子；RasV4为直径约为3.nm的球状病毒粒子；RasV5也为球状病毒粒子，但有较为分明的棱角结构，且直径较大，约为4.nm。SDS-PAGE电泳分析，RasV4含有两条大小在5.kD的蛋白条带，且较大的条带浓度远高于较小的条带；RasV5同样含有两条蛋白条带，但一条在5.kD左右，一条在4.kD左右。RasV3的萝卜提取的病毒粒子未观察到明显的条带。RasV3克隆测序和分析结果显示，其基因组由两条大小相近的dsRNA组成(dsR1和dsR2)，GenBank数据库的序列号分别为FJ461349和FJ4613509。dsR1长160.bp，ORF预测及序列比对分析后，推测其编码由481个氨基酸残基组成的病毒复制酶RdRp，分子量为54 kD. dsR2长158.bp，最大开放阅读框编码一个由374个氨基酸残基组成的蛋白，分子量为42 kD，未在GenBank中检索到相似序列，但是根据病毒基因组结构推测此蛋白为病毒的外壳蛋白。以dsR1编码的RdRp与其相似序列构建的系统发生树表明，RasV3聚类到双分病毒亚组III，即应归类到提议的β-隐潜病毒属。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩语表

声明

第一章 文献综述

1.1.引言

1.2 潜隐性dsRNA病毒

1.2.1 真菌中的潜隐性dsRNA病毒

1.2.2 植物潜隐性dsRNA病毒

1.2.3 动物潜隐性dsRNA病毒

1.3 潜隐性dsRNA病毒因子与寄主的互作

1.4 萝卜中dsRNA病毒因子研究进展

1.5 研究目的及内容

1.5.1 研究目的

1.5.2 研究内容

第二章 双分病毒的进化关系及系统发生分析

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.3 结果分析

2.3.1 双分病毒系统发生分析

2.3.2 支持系统发生分析结果的数据

2.4 小结与讨论

第三章 一点红萝卜中三种新的dsRNA病毒

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料的保存

3.1.2 酶与试剂

3.1.3 病毒粒子提纯

3.1.4 病毒粒子的SDS-PAGE检测

3.1.5 从病毒粒子中提取基因组

3.2 结果与分析

3.2.1 dsRNA提取分析

3.2.2 病毒粒子电镜观察

3.2.3 病毒粒子的提取及病毒结构蛋白SDS-PAGE分析

3.2.4 病毒基因组提取

3.3 小结与讨论

第四章 一点红萝卜中一种新的双分病毒—RasV3的分子表征

4.1 材料与方法

4.1.1 毒源及dsRNA

4.1.2 酶与试剂

4.1.3 接头设计与合成

4.1.4 dsRNA片段的回收

4.1.5 M-SPAT合成dsRNA片段对应的cDNA

4.1.6 cDNA的克隆

4.1.7 重组质粒的分析

4.1.8 病毒基因组提取与分析

4.1.9 病毒基因组的RT-PCR检测

4.2 结果分析

4.2.1 dsRNA条带的回收与M-SPAT结果

4.2.2 阳性克隆筛选质粒鉴定及酶切鉴定结果

4.2.3 dsR1与dsR2 dsRNA特异性引物RT-PCR鉴定结果

4.2.4 病毒粒子的电镜观察

4.2.5 基因组RNA1与RNA 2的测序与结果分析

4.2.6 RasV3的系统发生分析

4.3 小结与讨论

总讨论

参考文献

致谢

攻读硕士期间研究成果