家蚕类COP9信号复合体蛋白基因的研究

摘要

COP9信号复合体(Constitutiv.Photomorphogeni.signalosom.CSN)是近年来备受关注的保守蛋白复合体，含有八个亚单位，其中第五亚基CSN5/JAB1在各物种中保守性最高，且内嵌有CSN的功能位点-JAMM基序。CSN以其异构酶活性参与蛋白的泛素化降解途径，调控细胞周期运转及生物体的生长发育过程。在对本实验室五龄幼虫的cDNA库进行检索中，发现一条长度为1227bp的基因，预测其编码的蛋白有349个氨基酸残基，相对分子量38 kDa，经NCBI比对发现，预测编码的蛋白具有完整的JAB-MPN保守结构域，与COP9信号复合体具有较高的同源性，将其命名为BmJM。将此基因插入到融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点，经PCR，双酶切鉴定重组质粒构建成功后，将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta中，IPTG终浓度0 mM-.mM，25-37℃均表达成功，但表达的重组蛋白都以包涵体形式存在。经过溶解液洗涤，将含有目的蛋白的上清经镍柱亲和层析和反相柱层析纯化后，以纯化的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得该蛋白的多克隆抗体，经ELISA检测，抗体效价可达1：25600以上。提取家蚕各个时期和组织的天然蛋白和总RNA，利用荧光定量PCR技术以及荧光Wester.blotting技术，分析BmJM基因在家蚕发育过程中不同时期及五龄幼虫各组织中的转录、表达情况。结果显示该基因mRNA在家蚕发育各时期的表达量由高到低依次为蛾、蛹、幼虫、卵，说明CSN伴随着家蚕发育的完善，作用逐步显现。在五龄幼虫各组织中，性腺和头部有着较多的BmJM蛋白表达量，在气门、脂肪体中则没有检测到该蛋白的存在，很可能表明CSN调控生物体的增殖发育过程。同时，以该抗体联合免疫荧光标记对家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位，发现BmJM蛋白在细胞质和细胞核内均有分布，主要定位于近核区域。这些实验数据不仅证明了COP9信号复合体在家蚕中的存在，也为CSN在调控家蚕生长发育过程中的重要作用提供了证据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章 COP9信号复合体蛋白综述

前言

1.1 COP9信号复合体的亚基组成及结构特征

1.2 COP9信号复合体的同源性

1.3 COP9信号复合体的功能

1.3.1 CSN与泛素化—蛋白酶体途径

1.3.2 CSN在生物体生长发育过程中的重要性

1.3.3 CSN的DNA损伤修复功能

1.3.4 CSN与细胞周期

1.4 CSN5/JAB1和CSN6

1.5 其他CSN亚基

1.5.1 CSN1/COP11/FUS6/GPS1

1.5.2 CSN2和CSN3

1.5.3 CSN8

展望

第二章 实验设计

1 实验的目的、意义

2 实验内容

第三章 生物信息学分析

1 序列与工具

1.1 序列

1.2 工具和软件

2 方法

3 结果

3.1 全长cDNA的生物信息学分析

3.2 BmJM的保守结构域

3.3 BmJM蛋白的疏水性

3.4 跨膜区分析

3.5 BmJM蛋白高级结构的预测

3.6 BmJM功能位点分析

3.7 BmJM氨基酸序列同源性分析

4 讨论

第四章 家蚕BmJM基因的克隆

1 材料与试剂

1.1 材料与设备

1.2 试剂的配制

2方法

2.1 重组表达质粒的构建

2.2 质粒提取

2.3 PCR扩增

2.4 PCR回收及纯化

2.5 PCR产物与pET-28a(+)载体的双酶切

2.6 连接反应

2.7 感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.8 连接产物的转化

2.9 重组克隆的筛选与鉴定

3 结果

3.1 重组质粒的构建

3.2 PCR扩增目的片段

3.3 重组克隆的鉴定

3.4 序列测定

4 讨论

第五章 重组蛋白的表达、纯化

1 材料与试剂

1.1 材料与设备

1.2 试剂

1.3 主要试剂的配制

2 方法

2.1 重组质粒在大肠杆菌中表达

2.2 SDS-PAGE电泳分析

2.3 包涵体的洗涤与溶解

2.4 镍柱亲和层析纯化重组蛋白

2.5 反相液相层析进一步纯化

3 结果

3.1 重组蛋白的诱导表达

3.2 重组蛋白包涵体经溶解液洗涤后的上清

3.3 Ni2+柱纯化重组蛋白，反相柱层析进一步分离

4 讨论

第六章 多克隆抗体制备及效价测定

1 材料与试剂

1.1 材料与设备

1.2 试剂

1.3 试剂的配制

2 方法

2.1 抗原制备

2.2 免疫动物

2.3 多克隆抗血清制备

2.4 抗体的效价测定(ELISA间接法)

3 结果

3.1 抗体的效价测定

4 讨论

第七章 荧光定量PCR及Western blotting分析

1 材料与试剂

1.1 材料与设备

1.2 试剂

1.3 试剂的配制

2 方法

2.1 Trizol法提取RNA

2.2 荧光定量PCR引物的设计

2.3 总RNA的DNA消化

2.4 总RNA的逆转录

2.5 荧光定量PCR

2.6 荧光定量PCR数据分析

2.7 总蛋白质的抽提

2.8 Western blotting

3 结果

3.1 家蚕发育过程中mRNA量的变化

3.2 五龄幼虫各组织中mRNA量的比较

3.3 家蚕四个发育时期及五龄幼虫八个组织RT-PCR扩增结果

3.4 五龄幼虫各组织中BmJM表达量的比较

4 讨论

第八章 亚细胞定位

1 试剂与材料

1.1 材料与设备

1.2 试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢

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