siRNA特异性及脱靶效应的研究

摘要

RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是指进化保守的小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)介导的抑制靶基因表达的现象。主要通过降解靶标mRNA从而抑制目标蛋白合成的转录后调控,有效抑制基因表达。参与这一过程的作用因子是siRNA(约21-23nt),作为关键的媒介与RISC蛋白在细胞质中结合,进而特异性的降解靶标mRNA。由于siRNA的这种特性可以抑制致病基因的突变位点,因此siRNA被广泛希望于作为新一代的生物临床治疗药物。
　　 RNA干扰过程中,siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实,siRNA还可以与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,这种现象称为siRNA的脱靶效应。
　　 siQuant系统以双荧光报告检测技术为基础,是一种检测siRNA抑制活性的高通量检测工具。在siQuant中引入siRNA的靶位点,siRNA的沉默效率可以通过荧光报告基团的活性直接反映出来。
　　 siRNA的沉默特异性和脱靶效应是其作为临床应用,特别是在选择性沉默SNP突变基因过程中遇到的关键问题。然而,目前尚没有设计等位基因特异性siRNA的可行性指导原则。本论文以基于siQuant的双荧光报告系统为主要检测手段,使用20条siRNAs和相应的240条错配靶序列,以siRNA的4、12和17三个位点为例,发现siRNA的错配容忍模式是由其错配位点决定的,在不同位置具有不同的错配容忍模式,并且不受周围序列的影响。本论文进一步使用20条siRNAs和相应的260条错配靶序列对siRNA的错配模式进行了全面研究,建立了siRNA各碱基在各位点的错配容忍模式图谱。
　　 根据上述得到的siRNA各碱基各位点错配容忍规律,将错配位点放置在siRNA高敏感区域,从而实现将完全匹配与单碱基错配选择性地沉默,即通过人为设计等位基因特异性siRNA来有效抑制突变治病的等位基因而对正常基因的影响达到最小。本论文设计抑制PIK3CA基因的两个致病突变位点的特异性siRNA,成功地对PIK3CA基因的两个致病突变位点进行了选择性沉默。
　　 本论文建立的siRNA错配容忍模式可以为等位基因特异性siRNA的设计提供可行的规律,选择性的基因沉默对治疗因SNP导致的疾病具有重大价值,为siRNA作为临床治疗药物研究提供有力的技术支持。