家蚕细胞中miRNA的检测、过表达及上调miRNA潜在靶基因的筛选

摘要

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的长约21-25nt的单链小RNA分子，线虫、果蝇、家蚕、人及拟南芥等生物中普遍存在。miRNA通过与靶基因mRNA特异性结合，诱导靶基因mRNA的降解或抑制蛋白的合成，从而参与调节细胞的增殖、分化、调亡、信号转染及肿瘤发生等多种生理学过程。目前，已有大部分的miRNA通过计算机和实验方法发现，其中家蚕有489条pre-miRNAs和567条成熟的miRNAs被鉴定，但对其功能还知之甚少。miRNA功能研究一般在细胞中上调或下调miRNA，通过gain-of-function或loss-of-function研究miRNA的靶基因和功能。目前为止，家蚕miRNA相关功能研究还很少。
　　 本文采用转染miRNA真核表达载体或化学合成的miRNAmimics上调BmN细胞中miRNA的水平，从而研究miRNA的靶基因及其功能。首先通过miRNA基因芯片检测家蚕BmN细胞中内源表达的miRNAs，结果显示:只有73条家蚕miRNA被鉴定。因此，选择4条低表达或无表达的且在其它物种中起重要基因调控作用的miRNA在家蚕细胞中表达。首先将EGFP基因克隆至带有杆状病毒iel启动子、hr5增强子的昆虫系统真核表达载体pIEx-1上，形成可用于表达miRNA的重组表达载体pIEx-1-EGFP。然后将pri-mir-1a/8/14/133克隆至pIEx-1-EGFP载体中EGFP基因的下游，形成重组载体pIEx-1-EGFP-pri-mir-1a/8/14/133，转染至家蚕BmN细胞中表达成熟的miRNA;Stem-IoopRT-PCR结果显示，重组载体pIEx-1-EGFP-pri-mir-1a/8/14/133成功转染至家蚕BmN细胞，与对照组相比，转染pIEx-1-EGFP-pri-mir-1a/8/14/133重组质粒的家蚕BmN细胞中bmo-miR-1a，bmo-miR-8，bmo-miR-14，bmo-miR-133的相对表达量分别提高了32，4.4，6.6和3910倍:同时将化学合成的bmo-miR-1a/8/14mimics转染至家蚕BmN细胞，结果显示，bmo-miR-1a/8/14mimics成功转染至家蚕BmN细胞，与对照组相比，bmo-miR-1a，bmo-miR-8，bmo-miR-14的水平分别上调了56，39和2933倍;Northernblot进一步验证重组质粒pIEx-1-EGFP-pri-mir-133在家蚕细胞中能够有效的表达成熟的bmo-miR-133。由上可知，我们成功的在家蚕细胞中上调了bmo-miR-14/133基因。为了开展bmo-miR-14/133靶基因的筛选及其功能研究，表达谱芯片及双向电泳分析了miR-14/133基因上调对家蚕细胞基因mRNA及蛋白表达水平的影响，结果表明:bmo-miR-14改变了家蚕细胞中某些mRNA和蛋白的表达水平，mRNA水平差异基因有13条，其中表达下调的基因有6条;蛋白表达水平下调的基因有16条，主要为核糖体蛋白，翻译起始因子等。bmo-miR-133也使家蚕细胞中基因的mRNA及蛋白表达发生了改变，mRNA水平差异基因有9条，其中表达下调的基因有8条;bmo-miR-133使14-3-3蛋白的表达水平下调。进一步，miRNA靶位点分析表明，mRNA水平及蛋白表达水平下调的基因3'UTR区都存在潜在的相应miRNA结合位点，是miRNA潜在的靶基因，后续研究拟开展这些结合位点的双荧光素酶体外验证实验。本课题为进一步开展bmo-miR-14/133在家蚕中的基因调控功能打下基础。