乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM的构建及黄酮类化合物逆转耐药性的研究

摘要

乳腺癌是女性多发的恶性肿瘤之一，对女性的身心健康造成严重威胁。在乳腺癌的化疗过程中很容易产生肿瘤多药耐药性(Multidrugresistance，MDR)MDR是化疗成功的主要障碍，对肿瘤的治疗极为不利。深入研究肿瘤细胞的耐药机制，寻找关键的靶点，针对靶点设计逆转肿瘤细胞多药耐药性的药物，为乳腺癌患者的治疗带来希望。近年来，国内外学者致力于对肿瘤多药耐药逆转剂的开发研究，大量研究证实许多黄酮类化合物对多种肿瘤细胞有一定抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖、影响其细胞周期的分布或诱导肿瘤细胞的凋亡，却对正常细胞低毒或无毒，黄酮类化合物在逆转肿瘤耐药性方面的研究引起高度关注。因此，本论文选择10种结构不同黄酮类化合物与阿霉素联合作用MCF-7细胞，研究黄酮类化合物对阿霉素的增敏作用，在该基础上构建乳腺癌阿霉素耐药细胞系MCF-7/adm，用上述黄酮类化合物逆转该耐药细胞系的耐药性。
　　主要研究内容与结果如下:
　　1.通过MTT法检测10种黄酮类化合物与阿霉素联合作用，对阿霉素抑制MCF-7增殖的影响，而且通过hochest33342染色观察黄酮类化合物与阿霉素联合作用MCF-7细胞较阿霉素单独作用时的细胞凋亡情况，并且通过流式细胞术对细胞凋亡的影响进行定量分析。结果表明:3，5，7，4'-4OH黄酮、5，7-2OH黄酮、5-OH-3'-OCH3黄酮、7-OH-3'-OCH3黄酮、6-OH-3'-OCH3黄酮、5，7，4'-3OH黄酮、7-OH-2'-OCH3黄酮都促进阿霉素对MCF-7增殖的抑制作用，而5，7，3'，4'-4OH黄酮，Neodiosmin，Rutin则没有该效果。Hochest染色以及流式细胞术结果与MTT结果一致，5，7，3'，4'-4OH黄酮，Rutin，Neodiosmin与阿霉素联合作用较阿霉素单独作用凋亡率低，另外7种黄酮类化合物与阿霉素联合作用比阿霉素单独作用凋亡率高。
　　2.采用大剂量间歇诱导法诱导MCF-7细胞，建立阿霉素耐药的人乳腺癌细胞系MCF-7/Adm，并通过MTT法检测耐药模型较野生株的耐药倍数，流式细胞术检测细胞内药物的积累量，以及real-timePCR检测多药耐药的标志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表达变化。结果显示:阿霉素耐药的乳腺癌细胞系MCF-7/Adm诱导成功，阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm细胞存活的IC50值分别为0.535μg/mL和173.275μg/mL，耐药倍数为324。流式细胞术检测MCF-7细胞中的阿霉素积累量明显高于MCF-7/Adm;MCF-7/Adm细胞中mRNA水平ABCB1基因表达明显上调，ABCG2和ABCC1基因表达下调。
　　3.通过MTT法检测10种黄酮类化合物对MCF-7/Adm细胞耐药性的逆转效果，结果显示3，5，7，4'-4OH黄酮、5，7-2OH黄酮、7-OH-3'-OCH3黄酮、6-OH-3'-OCH3黄酮、5-OH-3'-OCH3黄酮、7-OH-2'-OCH3黄酮作用后，阿霉素对MCF-7/adm的IC50值都小于阿霉素单独作用的值，说明这6种黄酮化合物对MCF-7/adm耐药性都有一定的逆转作用。但由于所选黄酮类化合物的结构不同，他们的逆转作用的有所不同。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1 肿瘤多药耐药性的研究

1．1 耐药细胞株模型的构建

1．2 肿瘤多药耐药机制的研究

2．肿瘤多药耐药逆转的研究

2．1 多药耐药性化学逆转剂的研究

2．2 肿瘤多药耐药天然药物逆转剂的研究

3 黄酮类化合物抗肿瘤及逆转耐药性的研究

3．1 黄酮类化合物的抗肿瘤研究

3．2 黄酮类化合物逆转肿瘤多药耐药性的研究

第二章 黄酮类化合物联合阿霉素对乳腺癌细胞MCF-7增殖及凋亡的影响

1 前言

2 实验材料、试剂与仪器

2．1 细胞株

2．2 试剂

2．3 黄酮类化合物

2．4 实验仪器

3 实验方法

3．1 细胞培养及药物制备

3．2 MTT检测黄酮类化合物对MCF-7细胞的细胞毒性

3．3 MTT检测黄酮类化合物作用前后ADR对MCF-7细胞的抑制率及IC50值

3．4 MTT检测不同浓度黄酮类化合物对ADR敏感性影响

3．6 流式细胞术检测黄酮类化合物联合阿霉素对MCF-7细胞凋亡影响

4 结果

4．1 MTT检测黄酮类化合物对MCF-7细胞的细胞毒性

4．2 MTT检测黄酮类对阿霉素化疗敏感性的影响

4．3 Hochest33342染色观察黄酮类化合物作用后阿霉素对MCF-7细胞凋亡的影响

4．4 流式细胞术检测黄酮类化合物联合阿霉素对MCF-7细胞凋亡影响

5 讨论

第三章 乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR的构建及耐药性的研究

1 前言

2 实验材料、试剂与仪器

2．1 细胞株

2．2 试剂

2．3 实验仪器

3 实验方法

3．1 MCF-7细胞株的培养

3．2 耐药人乳腺癌细胞模型MCF-7／Adm的建立

3．3 MTT法检测MCF-7／Adm细胞系的耐药指数

3．4 流式细胞术测定细胞内药物的积累量

3．5 实时荧光定量PCR检测MCF-7／Adm细胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表达

4 结果

4．1 大剂量间歇诱导出MCF-7／Adm细胞

4．2 ADM对MCF-7和MCF-7／Adm细胞毒性作用及耐药指数的检测

4．3 MCF-7和MCF-7／Adm细胞内阿霉素药物蓄积量的测定

4．4 Real-time PCR检测MCF-7／Adm细胞中多药耐药的标志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表达

5 讨论

第四章 黄酮类化合物对乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADM的耐药性逆转作用

1 前言

2 实验材料、试剂与仪器

2．1 细胞株

2．2 试剂

2．3 实验仪器

3 实验方法

3．1 MTT检测黄酮类化合物对MCF-7／ADR耐药性的逆转倍数

4 结果

4．1 MTT检测黄酮类化合物对MCF-7／ADR耐药性的逆转倍数

5 讨论

第五章 结论与展望

参考文献

致谢