家蚕杆状病毒基因Bm122功能的研究

摘要

家蚕杆状病毒表达系统在具有复杂的翻译后修饰的蛋白质表达以及疫苗和杀虫剂生产等方面具有很多重要的应用。但家蚕杆状病毒表达系统高效表达外源蛋白的机制并不清楚，而且杆状病毒感染过程中的自身DNA复制和基因表达调控机理也未阐明，参与基因表达调控的许多蛋白因子的功能也未可知。为此，本研究选择家蚕杆状病毒的一个未知功能基因Bm122，对该基因进行功能研究。
　　对杆状病毒基因组进行基因敲除被公认为是研究病毒基因功能精确且有效的手段，尤其是在研究目的基因在整个感染周期中对病毒DNA复制和基因表达的调控作用方面。本文采用Red重组技术敲除Bm122基因来研究该基因的功能。家蚕杆状病毒基因Bm122位于家蚕核型多角体病毒基因组116323nt-116928nt，编码框总长为606bp，编码的氨基酸数为201个，编码的蛋白大小为23 kD左右，Bm122编码的蛋白主要存在于细胞核内。鳞翅目NPV和GV中都有Bm122的同源基因，其同源基因Ac146是AcMNPV必需基因。有人推测Bm122的缺失可能会影响BmNPV的复制或者晚期基因的表达。
　　为研究Bm122的功能，运用Red重组技术构建了Bm122-ko-bacmid，实现对Bm122基因的敲除;为消除Bm122基因的敲除对其上下游基因正常功能的影响，PCR扩增出Bm122基因的完整开放阅读框，利用Bac-to-Bac系统构建了Bm122-re-bacmid，实现对Bm122基因的异位补回。Bm122-ko-bacmid、Bm122-re-bacmid、wtbacmid（野生型）分别转染BmN细胞，在转染后的不同特定时相收集细胞培养液上清，TCID50(50％ tissue culture infectivedose)终点稀释法测定三种病毒的滴度，发现Bm122缺失后病毒的滴度在各时相均为零，表明Bm122缺失后细胞内可能无法产生正常水平的BV(budded virus);为深入研究Bm122基因缺失如何影响病毒正常增殖，将三种bacmid转染家蚕细胞后透射电镜观察，结果表明Bm122敲除后细胞内只见少许类似多角体结构，进一步证实Bm122的缺失降低了BV的生成水平，并且影响BV的正常形态。三种bacmid转染细胞后，收集不同时间点的细胞，提取总DNA，DpnⅠ消化外源bacmid后，进行荧光定量PCR，比较三种病毒的复制水平。同时使用纯化的wtbacmid按一定的稀释倍数稀释后，进行荧光定量，获得病毒DNA复制的拷贝数指数与荧光定量所得的Ct值之间的线性关系，将上述荧光定量PCR所获得的Ct值换算成基因的拷贝数，然后对三种病毒复制水平进行比较。结果表明Bm122敲除后，病毒的复制水平明显降低，可能是由于Bm122-ko-bacmid型病毒不能发动第二次感染引起的。将Bm122-ko-bacmid和wtbacmid分别转染家蚕BmN细胞后，收集细胞进行western blot实验，使用LEF-3单克隆抗体孵育后显色，结果表明Bm122的缺失不影响lef-3正常表达。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 绪论

1 杆状病毒的简介

1．1 杆状病毒分类

1．2 杆状病毒生活史

2 杆状病毒基因的研究

2．1 杆状病毒基因组结构

2．2 杆状病毒基因的表达与调控

3 杆状病毒的应用

4 家蚕杆状病毒基因简介

5 家蚕杆状病毒Bm122基因研究进展

6 实验方案设计

第二章 Bm122基因生物信息学分析

1 Bm122基因生物信息学分析

1．1 Bm122基因序列分析

1．2 BM122蛋白疏水性分析

1．3 BM122蛋白信号肽分析

1．4 BM122蛋白的跨膜区分析

1．5 BM122蛋白的二级结构分析

2 讨论

第三章 家蚕核型多角体病毒Bm122敲除和补回型病毒的构建

1 材料与方法

1．1 材料及主要试剂

1．2 Bm122基因缺失型bacmid的构建

1．3 Bm122基因补回型bacmid的构建

2 结果与分析

2．1 Bm122基因打靶线性化片段的鉴定

2．2 Bm122基因缺失型bacmid的鉴定

2．3 重组转移载体pFastBacHTB-Bm122的鉴定

2．4 Bm122基因补回型bacmid的鉴定

3 讨论

第四章 Bm122缺失对BmNPV复制的影响

1．材料与试剂

2．原理与方法

2．1 原理

2．2 BmN细胞的冻存、复苏与培养

2．3 三种bacmid转染BmN细胞

2．4 病毒滴度测定

2．5 病毒基因组的提取和消化

2．6 荧光定量PCR引物设计

2．7 荧光定量PCR标准曲线的绘制

2．8 qPCR反应

3 结果与分析

3．1 三种bacmid转染后BmN细胞的状态

3．2 病毒滴度分析

3．3 Bm122基因缺失对BmNPV基因组复制影响分析

4 讨论

第五章 Bm122缺失对BmNPV病毒基因表达的影响

1 材料与试剂

2 方法

2．1 western blot样品准备

2．2 转膜

3 结果与分析

第六章 透射电子显微镜观察

1 材料与试剂

2 电子显微镜分析

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢