HBV阳性肝癌血清miRNA标志物的筛选及HBV编码miRNA的预测与鉴定

摘要

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于临床缺乏有效的预防、检测及治疗手段，大多数患者发现时已属癌症中晚期，且预后较差，因此寻找可靠的生物标志物用于肝癌诊断和预后判断具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是一类内源性的，长度约为22nt的非编码功能性RNA，由于RNAase的保护作用在血清或血浆中表现出高度的稳定性。研究表明miRNA扮演着癌基因或抑癌基因的角色，并能同时调节多个基因，通过结合靶mRNA的方式参与调控肿瘤的发生发展。因此认为miRNA在肝癌和正常血清样本中呈现显著的差异表达水平，对肝癌筛查和诊断具有潜在的指示作用。
　　本论文从杭州西溪医院共收集未经过任何化疗处理的52例肝癌血清样本和25例正常对照样本，对乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）阳性肝癌样本和正常样本各5例分别混合得到两个混合样，构建miRNA文库进行miRNA表达谱测序。通过对高通量测序所得的数据进行分析处理，共获得172条在肝癌和正常血清样本中差异表达的miRNAs，结合文献报导筛选了三条差异表达的miRNAs进行大样本量验证。相对于正常对照样本，miR-182-5p、363-3p和378a-3p在肝癌样本中显著高表达，并达到极显著水平（P<0.01），且这三条目标miRNAs也能较好地区分HBV阳性肝癌和正常样本，在临床诊断中具有广泛的科研价值和临床应用前景。
　　为探究乙型肝炎病毒是否能够编码miRNA，与宿主mRNA靶向结合来参与病毒感染的调控机制，本论文通过Vir-Mir数据库预测乙肝病毒编码的pre-miRNAs，并结合miRNA表达谱测序和实时荧光定量PCR方法验证成熟体miRNA。结果显示HBV阳性肝癌血清样本中存在六条候选 pre-miRNAs，并成功验证其中一条成熟体命名为hbv-miR-15467，为病毒性肝病的治疗策略提供了新的思路。

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略语表

一 文献综述

1 miRNA概论

2 肝脏中特异性表达的miR-122

3 miRNA在肝细胞癌中的临床应用

4 miRNA在肝细胞癌发生发展中的调控机制

5 乙肝病毒编码miRNA的研究进展

6 展望

二 实验方案设计

1 研究目的和意义

2 研究主要内容

3 实验流程

三 材料和方法

1 材料

2 方法

四 结果和分析

1 样本总RNA的质量分析

2 高通量测序结果及数据分析

3 HBV阳性肝癌血清标志物的筛选

4 HBV编码miRNA的预测与验证

5 讨论

五 总结与展望

1．结论

2. 问题

参考文献

致谢

研究生学习期间主要成果

附录 重要试剂的配制