COPD动态miRNA表达谱的构建及血清miRNA分子标志物的筛选与鉴定

摘要

背景:COPD是一个严重的公共卫生问题，其发病率逐年增高与吸烟和大气污染日益严重相关。COPD主要特征包括慢性支气管炎和肺气肿，临床表现为进行性发展的气流受限和肺部异常炎症反应。COPD患者病情反复急性加重可以增加发病率和死亡率。吸烟是COPD发病最重要的危险因素，与95％的COPD发病有关。然而早期COPD患者缺乏特异性症状，目前尚无公认COPD发生发展的相关分子标志物，因此在COPD患者和高危人群中寻找分子标志物，有助于COPD的早期防治。miRNAs是一类长约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与靶基因3'端非翻译区结合发挥抑制翻译作用或导致mRNA完全降解。目前已发现数千种miRNAs，可参与调节许多重要生物学过程如:发育、凋亡、细胞增殖、造血等。miRNA在血清及血浆中非常稳定地存在，可以抵抗内源性RNA酶，在多种储存条件和反复冻融情况下亦可保持稳定。近年来研究发现循环miRNA可能成为一些疾病的分子标志物如:肺癌、胃癌、败血症和肺结核等。目前在COPD发展过程中血清miRNA的相关研究甚少，仅一项土耳其小样本研究发现COPD外周血清存在miRNA表达异常，且miRNA在COPD发病机制中发挥何种作用仍不清楚，血清miRNA是否可能成为COPD早期诊断标志物，有赖于进一步深入研究。
　　目的:本研究拟通过建立COPD动态大鼠模型，了解肺部病理改变，同时对COPD不同时期大鼠肺组织进行miRNA表达谱分析，将差异表达的miRNA进行生物信息学分析。并在此基础上，选择差异表达miRNA在COPD患者外周血清中进行检测，以寻找COPD早期诊断分子标志物。
　　方法:1、将雄性Wistar大鼠随机分为6组，包括对照组、吸烟2周组、吸烟4周组、吸烟6周组、吸烟8周组、吸烟15周+气管内滴注猪胰弹性蛋白酶组，每组各5只，建立香烟诱导COPD动态大鼠模型，同时进行病理学观察其形态学改变。2、取对照组、吸烟4周组、吸烟15周+气管内滴注猪胰弹性蛋白酶组大鼠肺组织各2例用于miRNA表达谱芯片分析。3、实时荧光定量PCR法检测异常表达miRNA，验证芯片数据。4、运用生物信息学法对miRNA表达谱进行靶基因预测、聚类分析及GO和Pathway分析。5、将研究对象分为健康对照组、重度吸烟组、COPD组，共收集各组外周血清及临床资料。6、运用实时荧光定量PCR法检测各组外周血清miR-21、miR-181a、miR-146a表达水平。7、对血清miR-21、miR-181a表达进行ROC分析。
　　结果:1、成功建立COPD动态大鼠模型，大鼠肺组织出现早期以炎症细胞浸润为主晚期出现肺气肿改变的动态病理变化。2、成功建立miRNA动态表达谱，在熏烟4周组共有30个miRNAs异常表达，熏烟15周组共有37个miRNAs异常表达。3、对表达差异较明显的6个miRNAs进一步进行验证，结果显示miR-206、miR-146a、miR-147、miR-21、miR-181a和miR-92a-2*的变化趋势与miRNA芯片数据一致，证实了芯片数据的可靠性。4、生物信息学分析显示异常表达的miRNA可能与COPD发病机制密切相关。5、共收集健康对照组41名、重度吸烟组40名、COPD组49名，重度吸烟组和COPD组外周血清miR-21较正常组增高，而miR-181a表达水平较正常组较低。COPD外周血清miR-21、miR-181a变化与肺功能相关。6、ROC分析结果显示血清miR-21/miR-181a具有较高敏感性(85.4％)和特异性(85.0％），曲线下面积0.910（95％CI:0.846-0.974），有望成为COPD早期诊断的分子标志物。
　　结论:1、成功建立动态COPD大鼠模型及miRNA表达谱。2、通过生物信息学分析异常表达的miRNA(miR-206、miR-146a、miR-147、miR-21、miR-181a和miR-92a-2*)可能在COPD发病机制中发挥重要作用。3、联合检测外周血清miR-21和miR-181a的表达水平并计算二者比值，可能成为COPD早期诊断新的分子标志物。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 动态COPD大鼠模型的建立与miRNA表达谱的构建

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 动态COPD大鼠模型评价

3．2 动态COPD大鼠模型肺组织病理学特征

3．3 动态COPD大鼠模型miRNA芯片表达谱

3．4 芯片结果验证

4 讨论

4．1 动态COPD大鼠模型的构建

4．2 动态COPD大鼠模型miRNA芯片表达谱

4．3 miRNA芯片数据验证

5 结论

第二部分 COPD动态miRNA表达谱的生物信息学研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料(分析软件及数据库)

2．2 方法

3 结果

3．1 分层聚类分析

3．2 差异表达miRNA splinecluster聚类分析

3．3 差异表达miRNA靶基因预测

3．4 基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析

3．5 信号通路(Pathway)分析

4 讨论

4．1 miRNA动态表达谱的聚类分析

4．2 miRNA靶基因预测

4．3 miRNA动态表达谱的GO和Pathway分析

5 结论

第三部分 COPD患者血清miRNA分子标志物的筛选与鉴定

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 研究对象人口学和临床特征调查

3．2 血清miRNA候选分子标志物筛选

3．3 COPD患者外周血清miR-21，miR-181a和miR-146a的表达

3．4 COPD患者外周血清miR-21，miR-181a表达水平与肺功能的关系

3．5 COPD患者血清miR-21，miR-181a的ROC分析

4 讨论

4．1 COPD诊疗现状

4．2 循环miRNA有望成为多种疾病的分子标志物

4．3 COPD相关血清miRNA的表达

4．4 COPD相关异常表达的血清miRNA作用与意义

4．5 血清miRNA-21和miR-181a表达水平的ROC分析

5 结论

参考文献

综述 miRNAs与肺部疾病

攻读学位期间主要成果

致谢