麻疹病毒核酸等温扩增试纸条快速检测技术的研究与应用

摘要

麻疹是由麻疹病毒引起的以发热、出疹为特征的急性呼吸道传染病，该病传染性强，致死率高，是目前导致发展中国家儿童死亡的重要原因。20世纪60年代以来，麻疹疫苗开始广泛使用，使麻疹的发病率、死亡率大幅度降低，但据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计，全球每年仍有超过2千万麻疹病例。WHO制定的全球控制与消除麻疹计划中，麻疹的实验室检测是麻疹监测的重要组成部分。
　　本研究将逆转录环介导等温扩增技术（Reverse-transcriptase loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）与带防污染装置的横向流动试纸条检测技术（lateral flow dipstick,LFD）相结合，建立了一种麻疹病毒核酸快速检测的新方法。研究针对麻疹病毒血凝素基因设计6条RT-LAMP扩增引物与1条特异性检测探针，其中上游内引物与探针的5’端分别标记生物素（biotin）与异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC），进行带biotin标记的RT-LAMP反应,同时进行与FITC-探针的杂交，最后利用LFD对等温扩增产物完成可视化核酸试纸条检测。通过对检测体系的优化，建立的麻疹病毒RT-LAMP-LFD快速检测技术能在1h内完成对样本的检测（包括核酸提取），方法检测敏感性与荧光RT-PCR方法相同，达到10个RNA copies/μL，同时与其他常见呼吸道传染病病毒无交叉反应，具有良好的检测特异性。
　　收集494份疑似麻疹患者咽拭子标本，用本研究建立的RT-LAMP-LFD快速方法进行检测，同时与荧光RT-PCR法进行比较，结果显示两种方法对494份临床样本的检测结果无显著性差异。结果表明，本研究研发的麻疹病毒核酸RT-LAMP-LFD检测技术对疑似麻疹患者临床样本的检测速度快，而且灵敏度高、特异性好、操作简单、仪器依赖程度低，有望发展成为麻疹病毒核酸快速检测的有效手段。

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略语表

第一章 文献综述

1.1 麻疹与麻疹病毒

1.2麻疹的流行病学

1. 3我国麻疹的流行状况

1. 4 麻疹病毒实验室检测技术

1.5 麻疹病毒实验室检测技术展望

第二章 课题立题依据及方案设计

2.1 选题目的和意义

2.2研究内容

2.3技术路线图

第三章 麻疹病毒RT-LAMP-LFD快速检测技术的建立

3.1 材料与试剂

3.2 RT-LAMP检测引物的设计

3.3 病毒核酸RNA提取

3.4 麻疹H基因体外转录RNA标准品模板的制备

3.5麻疹病毒RT-LAMP-LFD快速检测方法的体系优化

3.6 RT-LAMP-LFD 体系优化结果

3.7 RT-LAMP-LFD 检测方法的特异性

3.8 RT-LAMP-LFD 检测方法的敏感性

3.9讨论

第四章 麻疹病毒RT-LAMP-LFD快速检测技术的临床应用

4.1 材料与试剂

4.2临床标本的平行检测

4.3检测结果与统计分析

4.3讨 论

第五章 全文小结与展望

5.1 全文小结

5.2 主要创新点

5.3 展 望

攻读学位期间的科研成果

致谢

参考文献

附录 实验用到的仪器设备