靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞(mesoCAR-T)治疗肝癌的实验研究

摘要

癌症现在已成为人类健康的头号杀手，世界范围内，肝癌发病率在所有癌症中居第六位，每年约有750万新增病例，死亡率高居第三位。快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。早期肝癌进行有效治疗后五年生存率能达到50％–70%。但是由于肝癌早期诊断技术的限制，肝癌总的五年生存率只有10%。目前常用的治疗手段主要包括手术切除、肝脏移植、化疗、化疗栓塞、射频消融、质子射线疗法等，但效果十分有限。因此，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高肝癌生存率和生存质量。近年来免疫疗法的兴起，即利用自身免疫系统来抵御癌症，给癌症患者带来了新的希望。
　　然而，癌症患者自身的免疫系统受损严重，狡猾的肿瘤细胞又会通过MHC分子的低表达或不表达来逃脱免疫细胞的攻击，这些都给治疗带来了很大困难。因此，精密制导、精准打击的免疫细胞武器—CAR-T技术应运而生。
　　CAR-T细胞，即嵌合型抗原受体修饰的T细胞，这种通过基因修饰T细胞的过继性免疫细胞疗法，可以克服MHC介导的免疫逃逸机制，快速建立肿瘤免疫并消除小型或大型肿瘤负担，被认为是一种很有前景的治疗策略。尤其是靶向CD19的CAR-T细胞在恶性血液病中取得的巨大成功，开创了肿瘤生物治疗的新纪元。
　　CAR-T技术虽在恶性血液病中获得惊人效果，运用到实体瘤时却处处碰壁，除了实体瘤更加复杂的肿瘤抑制微环境外，还面临着很多问题：缺乏类似于CD19这样特异的靶点，转染效率不高，CAR的数量和CAR的亲和力等。本文构建并检测了针对间皮素的第二代CAR T细胞对几种肝癌细胞株的体外杀伤作用：
　　(1)构建包含CD3ζ和4-1BB两个胞内共刺激区的mesoCAR，通过piggyBac转座子系统转染T细胞，获得mesoCAR-T细胞。替代常用的慢病毒载体转染方式，其阳性率可达到66%。流式检测K562-meso刺激下mesoCAR-T的活化表型（CD137，CD28，CD27，CD134，CD38，CD107α），结果显示mesoCAR-T细胞可被K562-meso细胞激活。
　　(2)通过RT-PCR、Western Blot检测多种肿瘤细胞株间皮素的表达水平，并人工构建间皮素高表达细胞株。筛选出了四种不同表达水平的肝癌细胞株，检测mesoCAR-T细胞对高表达（SMMC-7721、BEL-7404）及低表达细胞株（HepG2、Huh7）的杀伤作用差异。结果显示mesoCAR-T细胞对间皮素高表达细胞株的杀伤作用明显强于低表达或不表达间皮素的细胞株，表明构建的mesoCAR-T细胞具有一定的特异性。
　　(3)通过检测mesoCAR-T细胞的细胞因子发现，IFN-γ、TNF-α、IL2的分泌明显高于对照组T细胞。mesoCAR-T与肿瘤细胞共培养IFN-γ的分泌量与肿瘤细胞株间皮素的表达量也基本成正比关系。
　　(4)SMMC-7721小鼠移植瘤模型中，与PBS和control T细胞组相比，mesoCAR-T细胞治疗组对肿瘤的抑制作用更强，且能在体内更好地增殖。
　　本文构建的mesoCAR-T细胞，在转染效率、免疫细胞因子的分泌、体内外杀伤方面都表现出较好的效果，为其在临床上的应用奠定了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

缩略词表

目录

第一章 嵌合型抗原受体T细胞（CAR-T）概念及研究进展

1.1嵌合型抗原受体T细胞的概念

1.2 T细胞的抗肿瘤机制

1.3 CAR-T疗法的研究进展

1.4 间皮素作为肿瘤治疗靶点的研究进展

1.5 PB转座子

1.6本课题的研究内容

第二章 靶向间皮素的嵌合型抗原受体修饰的T细胞（mesoCAR-T）构建

2.1 实验器材

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4结果分析与讨论

第三章 间皮素高表达肝癌细胞株的筛选和人工构建

3.1实验器材

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4结果分析与讨论

第四章 mesoCAR-T细胞的功能分析

4.1 实验器材

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4结果分析与讨论

第五章 SMMC-7721小鼠移植瘤模型实验

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3实验结果

5.4结果分析与讨论

讨论

参考文献

致谢